【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，涉及一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、逆轉(zhuǎn)錄酶是使用rna為模板合成dna的酶，被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究以及從病原體檢測到轉(zhuǎn)錄組分析各種場景，涉及rt-pcr、rt-qpcr、rt-lamp、cdna文庫構(gòu)建等多種技術(shù)。在已知的逆轉(zhuǎn)錄酶中，來自moloney鼠白血病病毒的逆轉(zhuǎn)錄酶(mmlv?rt)是使用最廣泛也是最知名的一種。相較于其他逆轉(zhuǎn)錄酶，mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶具有更強的逆轉(zhuǎn)錄活性，并且表達(dá)純化工藝更適于商業(yè)化。但mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶野生型存在明顯的缺陷，其最適反應(yīng)溫度是37-42℃，高溫下極易失活。
2、而作為模板的rna容易形成二級結(jié)構(gòu)，這對于逆轉(zhuǎn)錄過程來說是極不利的，二級結(jié)構(gòu)可能會導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄過程提前終止，或者合成的cdna不完整、產(chǎn)量少及存在偏好性等問題。提高逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)溫度則有助于打開rna的二級結(jié)構(gòu)，改善cdna產(chǎn)物的質(zhì)量，但能打開rna二級結(jié)構(gòu)的溫度往往也讓逆轉(zhuǎn)錄酶失活，因此提高mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶的熱穩(wěn)定性勢在必行。另外，mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶熱穩(wěn)定性的提升，往往也伴隨著在高溫下反應(yīng)活性的提高和存儲穩(wěn)定性的提高，從而使技術(shù)更優(yōu)越、使運輸存儲更便利。
3、綜上所述，目前現(xiàn)有野生型mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶存在熱穩(wěn)定性差、無法耐高溫，難以適用于多種技術(shù)(如高溫逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，高溫rt-qpcr及高溫rt-lamp)應(yīng)用場景等問題。如何提供一種熱穩(wěn)定性優(yōu)異，高溫下催化活性高的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體已成為目前生物
亟待解決的問題之一。
技術(shù)實現(xiàn)思路b>
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和實際需求，本專利技術(shù)提供一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體及其應(yīng)用，解決了現(xiàn)有野生型mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶存在的熱穩(wěn)定性差、無法耐高溫，難以適用于高溫逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，高溫rt-qpcr及高溫rt-lamp等問題，獲得的突變型逆轉(zhuǎn)錄酶展示出提高的熱穩(wěn)定性、更高溫度下的反應(yīng)活性和/或額外的有益特性(提高的存儲穩(wěn)定性、提高的運輸穩(wěn)定性、改進(jìn)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)rna模板的cdna合成能力或提高的特異性)。
2、為達(dá)到此專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供了一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，所述突變體在氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括如下位點突變：
4、a46、s60、v88、s92、p100、v101、r121、p127、h143、k152、p166、r211、d216、a229、d339、q341、t420、l452、m457、t467、a500、g504、a539、l563、a589、l604、t605、s606、g608、e616、q639或a646中的任意一個或至少兩個的組合。
5、優(yōu)選地，所述突變體與seq?id?no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突變體在氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括如下位點突變：
6、a46p、s60k或s60r或s60h、v88k或v88r或v88h、s92c、p100v或p100g或p100s或p100a或p100y、v101g或v101i或v101c或v101n或v101f或v101k或v101r或v101y、r121c、p127s、h143c、k152i或k152q或k152e或k152d、p166c、r211s、d216q、a229c、d339e、q341e或q341d、t420v、l452c或l452k或l452r或l452h、m457c、t467n、a500p、g504p或g504s、a539c、l563c、a589k或a589r或a589h、l604n或l604d或l604e或l604y或l604g、t605i或t605s或t605p或t605v或t605d或t605e或t605r或t605k、s606f或s606v或s606h或s606g或s606r或s606k、g608m或g608s、e616c、q639c或a646c中任意一種或至少兩種的組合。
7、優(yōu)選地，所述突變體與seq?id?no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突變體在氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括如下突變：
8、s60、p100、v101、k152、r211、d216、d339、t420、l452、m457、l563、l604、t605、s606、g608、e616中任意一種或至少兩種的組合。
9、優(yōu)選地，所述突變體與seq?id?no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突變體在氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括如下位點突變：
10、s60k或s60r或s60h、p100v或p100g或p100s或p100a或p100y、v101g或v101i或v101c或v101n或v101f或v101k或v101r或v101y、k152i或k152q或k152e或k152d、r211s、d216q、d339e、t420v、l452c或l452k或l452r或l452h、m457c、l563c、l604n或l604d或l604e或l604y或l604g、t605i或t605s或t605p或t605v或t605d或t605e或t605r或t605k、s606f或s606v或s606h或s606g或s606r或s606k、g608m或g608s或e616c中任意一種或至少兩種的組合。
11、優(yōu)選地，所述突變體在氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上還發(fā)生包括如下突變：
12、m39、s56、m66、l99、d108、p111、l139、d200、t287、t330、p448、d449、s453、n479、a502、d524、h594、l603、i611、l630、h634、d653、l671中任意一種或至少兩種的組合。
13、優(yōu)選地，所述突變體在氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上還發(fā)生包括如下位點突變：
14、m39v、s56c、m66l、l99f或l99v或l99y或l99n或l99g或l99c、d108i或d108l或d108c或d108h、p111l、l139p、d200h或d200q、t287a、t330p、p448c、d449g、s453k、n479d、a502v、d524a、h594k、l603w、i611k或i611r或i611h、l630p、h634y、d653t或l671p中任意一種或至少兩種的組合。
15、優(yōu)選地，所述突變體氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括以下任意一種組合位點突變：
16、(1)l563c、g608s、e616c、h634y和d653t；
17、(2)s60r、d200q、a229c、s453k、d524a、l604n、t605d、g608m和i611r；
18、(3)d200q、a229c、t467n和l671p；
19、(4)s60r、p127s、本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于，所述突變體在氨基酸序列SEQ?IDNO.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括如下位點突變：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于，所述突變體與SEQ?ID?NO.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突變體在氨基酸序列SEQ?ID?NO.1的基礎(chǔ)上還發(fā)生包括如下突變：
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于，所述突變體氨基酸序列SEQ?ID?NO.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括以下任意一種組合位點突變：
4.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有權(quán)利要求1-3中任一項所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的編碼序列。
5.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體含有權(quán)利要求4所述的核酸分子。
6.一種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞含有權(quán)利要求4所述的核酸分子和/或權(quán)利要求5所述的重組載體。
7.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒含有權(quán)利要求1-3中任一項中所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其
9.權(quán)利要求1-3中任一項所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中的應(yīng)用；
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于，所述突變體保留逆轉(zhuǎn)錄酶活性；
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于，所述突變體在氨基酸序列seq?idno.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括如下位點突變：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于，所述突變體與seq?id?no.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突變體在氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上還發(fā)生包括如下突變：
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體，其特征在于，所述突變體氨基酸序列seq?id?no.1的基礎(chǔ)上發(fā)生包括以下任意一種組合位點突變：
4.一種核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有權(quán)利要求1-3中任一項所述的鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶突變體的編碼序列。...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉想，商曰朋，陽瑜紅，
申請(專利權(quán))人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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