【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種響應香草酸的vanr體外轉錄因子傳感器，屬于生物檢測領域。
技術介紹
1、對樣品中小分子的有效檢測，在醫藥生產、食品安全和環境污染等領域得到了廣泛的應用。對小分子的檢測方法主要有理化分析方法和生物分析方法。理化分析方法主要通過質譜、色譜及質譜-色譜連用技術，具有靈敏度和準確度高的特點。但其樣品前處理過程繁瑣，成本高，耗時耗力。生物分析方法主要是通過小分子與蛋白/核酸的特異性相互作用，實現信號的生成、放大、轉換和輸出。生物傳感器是由生物敏感元件與信號轉換器構成的分析裝置。是一種通過產生與反應中分析物濃度成比例的信號來測量生物或化學反應的裝置。生物傳感器用于諸如疾病監測、藥物發現和檢測污染物、致病微生物和作為體液(血液、尿液、唾液、汗液)中疾病指示物的標志物的應用中。
2、基于轉錄因子的生物傳感器。在自然界微生物體內，響應小分子的天然轉錄因子廣泛存在。其中在大腸桿菌中發現了超過200種的轉錄因子，它們能夠感知各種各樣的代謝物，包括氨基酸、糖類、糖磷酸和脂質等。但是全細胞生物傳感器具有較差的魯棒性、較長的響應時間以及穩定性和再現性較差。此外，引起的生物安全問題(例如，遺傳修飾的wcb擴散的風險)以及分析物的滲透性和毒性仍然是一個很大的障礙。出于這些考慮，體外轉錄因子傳感器具有獨特的優勢，具有可行性、可調節性、低成本和高穩定性、模塊化和兼容性的特點。
3、vanr是屬于padr家族的細菌的負轉錄調節因子，并且響應于香草酸調節香草酸轉運和降解蛋白的表達。vanr包含192個殘基(21kda)。與其
4、o-甲基轉移酶(omt)是香蘭素合成過程中的限速酶，香蘭素可以在香蘭素脫氫酶(vdh)的催化下進一步轉化為香草酸，在體系中共表達omt和vdh，可以通過檢測香草酸的量來間接反映omt酶活的高低，香草酸的量越多，說明香蘭素生成的越多，omt的活性越高。然而如何構建一種用于感應香草酸的生物傳感器是不明晰的，因此亟待開發出一種可用于香蘭素生物合成過程中的限速酶o-甲基轉移酶(omt)的高通量篩選的體外香草酸生物傳感器。
技術實現思路
1、針對上述現有技術的不足，本專利技術提出了一種響應香草酸的vanr體外轉錄因子傳感器，目的在于解決目前vanr全細胞生物傳感器的魯棒性較差、響應時間較長以及穩定性和再現性較差，并且還沒有體外的香草酸生物傳感器的技術問題。
2、本專利技術提供的第一個技術方案為一種用于檢測香草酸的生物傳感器，所述生物傳感器包含識別元件和換能元件，所述識別元件為別構轉錄因子vanr；所述換能元件包含換能dna片段和至少一種換能蛋白，所述換能dna片段包含別構轉錄因子作用位點和換能位點；
3、其中，所述別構轉錄因子與其作用位點的結合阻礙至少一種所述換能蛋白與換能位點的結合，所述別構轉錄因子與所述小分子的結合改變所述別構轉錄因子與所述換能dna片段的相互作用；
4、其中，所述換能dna片段在所述轉錄因子作用位點處為雙鏈，所述換能蛋白包括dna聚合酶、限制性核酸內切酶。
5、在某些實施方式中，別構轉錄因子vanr來自谷氨酸棒狀桿菌corynebacteriumglutamicum(accession：6lg2)。別構轉錄因子vanr的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
6、在某些實施方式中，所述換能dna片段包括seq?id?no.1和seq?id?no.2，
7、seq?id?no.1：
8、aacccaacccgccctacccaacctcagcaactaactaagagtttaggtatttggtta?caacg-p；seqid?no.2：cgttgtaaccaaatacctaaactcttagttagtt。seq?id?no.1中的p代表磷酸化修飾。
9、在某些實施方式中，所述換能位點與別構轉錄因子作用位點鄰近或重疊，所述別構轉錄因子vanr作用位點為aactaactaagagtttaggtatttggtt。
10、在某些實施方式中，至少一種所述換能蛋白為dna聚合酶。
11、本專利技術提供第二個技術方案為一種對樣品中的小分子進行檢測的方法，所述方法包括將所述樣品與第一個技術方案所述的生物傳感器接觸，并檢測dna擴增的產物，所述小分子為香草酸。
12、在某些實施方式中，所述方法包括如下步驟：
13、s1、設計并合成換能dna片段；
14、s2、將待測樣品、別構轉錄因子vanr與步驟s1的換能dna片段混合孵育；
15、s3、向步驟s2獲得的混合物中加入引起鏈斷裂的限制性核酸內切酶、dntp和dna聚合酶進行擴增，并檢測擴增產物檢測；
16、s4、基于熒光的檢測方法，具體是加入熒光染料tht，當g4鏈體和tht結合后，在425nm的激發光和482nm的發射光下具有最大熒光值；
17、s5、基于比色法的檢測方法具體是將步驟s3獲得的溶液與氯化血紅素孵育，隨后向其中加入abts2-和h2o2，通過吸光度對生成的g四鏈體進行檢測。
18、在某些實施方式中，s1中，設計了兩條引物，分別是t和p即為換能dna片段，t的序列(seq?id?no.1)為：
19、aacccaacccgccctacccaacctcagcaactaactaagagtttaggtatttggtta?caacg-p，p的序列(seq?id?no.2)為：cgttgtaaccaaatacctaaactcttagttagtt。
20、在某些實施方式中，s1中，引物t和p等量加入體系中，95度熱變性5min，再緩慢冷卻至室溫，形成部分結合的雙鏈片段。
21、在某些實施方式中，s2中，將待測樣品、別構轉錄因子vanr與s1得到的dna片段于室溫下混合孵育20min。
22、在某些實施方式中，s3中，在步驟s2的混合物中加入引起鏈斷裂的限制性核酸內切酶nb.bbvci、dntp和dna聚合酶，dna聚合酶和香草酸存在競爭關系，當存在香草酸的情況下，香草酸與vanr特異性結合，vanr從換能dna片段上游離出來，nb.bbvci識別換能dna上的nb.bbvci限制性酶切位點并造成鏈的斷裂，dna聚合酶對引物延伸擴增得到大量g4鏈體。
23、在某些實施方式中，s4中，基于熒光的檢測方法具體是：在s3得到的溶液中加入熒光染料tht，當在s3中擴增得到的大量g4鏈體和tht結合后，在425nm的激發光本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于檢測香草酸的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器包含識別元件和換能元件，所述識別元件為別構轉錄因子VanR；所述換能元件包含換能DNA片段和至少一種換能蛋白，所述換能DNA片段包含別構轉錄因子作用位點和換能位點；
2.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述別構轉錄因子VanR來自谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium?glutamicum)；所述換能DNA片段包括SEQ?ID?NO.1和SEQ?IDNO.2。
3.根據權利要求2所述的生物傳感器，其特征在于，所述別構轉錄因子VanR作用位點為AACTAACTAAGAGTTTAGGTATTTGGTT，所述換能位點與別構轉錄因子作用位點鄰近或重疊。
4.一種對樣品中的小分子進行檢測的方法，其特征在于，所述方法包括將所述樣品與權利要求1～3任一項所述的生物傳感器接觸，并檢測DNA擴增的產物，所述小分子為香草酸。
5.根據權利要求4所述的生物傳感器，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據權利要求5所述的生物傳感器，其特征在于，S1中，設計了兩條引物，
7.根據權利要求5所述的生物傳感器，其特征在于，S2中，換能DNA片段每條單鏈的加入量為100-400nM，VanR加入量為40～100nM。
8.根據權利要求5所述的生物傳感器，其特征在于，S3中，擴增反應的時間為15～40min；Nb.BbvCI限制性核酸內切酶的加入量為1～3U，DNA聚合酶的加入量為0.25～1.0U。
9.根據權利要求5所述的生物傳感器，其特征在于，基于熒光的檢測方法具體是：在S3的體系中加入熒光染料ThT，當在S3體系中擴增得到的大量G4鏈體和ThT結合后，在425nm的激發光和482nM的發射光下具有最大熒光值，生成的G4鏈體越多，熒光值越高；
10.權利要求1～3任一項所述生物傳感器或者4～9任一項所述的方法在檢測香草酸中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種用于檢測香草酸的生物傳感器，其特征在于，所述生物傳感器包含識別元件和換能元件，所述識別元件為別構轉錄因子vanr；所述換能元件包含換能dna片段和至少一種換能蛋白，所述換能dna片段包含別構轉錄因子作用位點和換能位點；
2.根據權利要求1所述的生物傳感器，其特征在于，所述別構轉錄因子vanr來自谷氨酸棒狀桿菌(corynebacterium?glutamicum)；所述換能dna片段包括seq?id?no.1和seq?idno.2。
3.根據權利要求2所述的生物傳感器，其特征在于，所述別構轉錄因子vanr作用位點為aactaactaagagtttaggtatttggtt，所述換能位點與別構轉錄因子作用位點鄰近或重疊。
4.一種對樣品中的小分子進行檢測的方法，其特征在于，所述方法包括將所述樣品與權利要求1～3任一項所述的生物傳感器接觸，并檢測dna擴增的產物，所述小分子為香草酸。
5.根據權利要求4所述的生物傳感器，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據權利要求5所述的生物傳感器...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張巖峰，彭冰冰，陳永麗，顧麗紅，張艷艷，鄒智蓉，張凱敏，
申請(專利權)人：深圳中科欣揚生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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