【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物分析檢測領域，具體涉及一種體外篩選單增李斯特菌溶血素o抑制劑的方法及應用和抑制劑。
技術介紹
1、單核細胞增生李斯特菌(簡稱單增李斯特菌，lm)屬于革蘭氏陽性菌，是一種條件致病菌，能夠感染人和動物。其主要通過食物傳播，特別容易感染老人、孕婦等免疫力低下的人群，可引起腸胃炎、腦膜炎、菱腦炎、敗血癥，還容易引發孕婦流產等，死亡率高達30％。由于它能忍受低溫、極端ph值，而且它的存在(尤其是在低污染水平下)很容易被忽視，這一細菌已經成為世界上最嚴重的病原體之一。
2、單增李斯特菌的致病性主要依賴其表達的幾種毒力因子,其中溶血素o(listeriolysin?o，llo)是單增李斯特菌感染細胞過程中重要的毒力因子之一。llo由hly基因編碼，屬于膽固醇依賴的細胞溶血素家族，它可以特異性地與吞噬泡膜上的膽固醇結合，形成孔裂解液泡膜，使細菌從吞噬泡中逃逸，進而避免了巨噬細胞的免疫攻擊并進入細胞質增殖。llo在單增李斯特菌毒力中的關鍵作用使之成為開發抗單增李斯特菌感染藥物的有效靶點。
3、目前，廣泛應用的llo抑制劑的篩選是通過檢測藥物存在的情況下，其對血紅細胞溶血活性的差異，來判斷藥物對llo蛋白成孔的抑制效果。但是，這一方法中使用的血紅細胞不容易獲得，且購買昂貴，且不能長期儲存，不適用于llo抑制劑的廣譜篩選。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種體外篩選單增李斯特菌溶血素o抑制劑的方法及應用和抑制劑。
2、為實現上述目的，本專利
3、一種體外篩選單增李斯特菌溶血素o抑制劑的方法，通過蛋白標簽法將具有熒光共振能量轉移效應的熒光小分子對分別標記到溶血素o，通過熒光小分子間的熒光共振能量轉移效應監控溶液中單增李斯特菌溶血素o的成孔活性，進而在體外篩選溶血素o的成孔抑制劑。
4、進一步的說，將蛋白標簽融合到溶血素o蛋白，然后通過標簽蛋白與底物的專一結合將fret給-受體熒光小分子對分別共價標記到溶血素o，而后通過熒光小分子間的熒光共振能量轉移效應監控單增李斯特菌溶血素o的成孔活性，進而在體外篩選溶血素o的成孔抑制劑。
5、所述蛋白標簽融合到溶血素o蛋白的c端，其中，蛋白標簽可選自snap、halo。
6、所述fret給-受體熒光小分子對可為cy3-cy5、熒光素-羅丹明6g、alexa488-alexa555、alexa488-cy3、aze-543染料。結構如下式所示，其中alexa相關染料為商業染料，可市購獲得，halo-aze染料引自專利cn111333576a。
7、
8、優選為染料aze與543。
9、具體為
10、(1)分別將帶有標簽蛋白專一底物的fret給-受體熒光小分子共價標記到溶血素o-蛋白標簽融合蛋白，并純化；
11、(2)溶液中加入1:0.2-1:5(優選1:1)摩爾比的fret給-受體熒光標記后的溶血素o，同時加入待篩選分子或對照，混合均勻，靜置1-30分鐘；
12、所述對照為陰性和陽性對照，陰性對照：加入1:0.2-1:5(優選1:1，比例與樣品組保持一致)摩爾比的fret給-受體熒光標記后的溶血素o；陽性對照：只加入fret給體熒光小分子標記的溶血素o。
13、(3)在上述溶液中分別加入10-500μg/ml膽固醇，孵育5-30分鐘，
14、(4)用熒光給體波長激發，采集熒光光譜；
15、(5)分析光譜數據，篩選得出單增李斯特菌溶血素o抑制劑。
16、所述步驟(1)中帶有標簽蛋白專一底物的fret給-受體熒光小分子為cy3-cy5、熒光素-羅丹明6g、alexa488-alexa555、alexa488-cy3、aze-543染料。
17、所述步驟(5)分析光譜數據，首先計算熒光受體(a)與熒光給體(d)最大發射峰的比值ia/d，然后應用以下公式計算樣品抑制溶血素o成孔的抑制效率，進而得出單增李斯特菌溶血素o抑制劑，
18、所述篩選得出單增李斯特菌溶血素o抑制劑能夠抑制溶血素o的成孔。
19、一種根據所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素o抑制劑的方法篩選出的抑制劑：結構如下所示
20、
21、一種所述的單增李斯特菌溶血素o抑制劑的應用，所述抑制劑在治療單增李斯特菌感染藥物中的應用。
22、本專利技術的優點和有益效果為：
23、本專利技術通過熒光標記llo建立fret體系來篩選llo成孔抑制劑，fret技術廣泛用于研究蛋白質的相互作用。相比于溶血活性檢測方法中昂貴和不穩定的血紅細胞的使用以及操作復雜性，fret通過熒光光譜技術更加經濟、簡便和直觀。另外，本專利技術通過基因工程法將蛋白標簽融合到llo蛋白后，可以將任一帶有該標簽底物的小分子熒光探針標記到llo蛋白上應用，方便快捷。
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1.一種體外篩選單增李斯特菌溶血素O抑制劑的方法，其特征在于，通過蛋白標簽法將具有熒光共振能量轉移效應的熒光小分子對分別標記到溶血素O，通過熒光小分子間的熒光共振能量轉移效應監控溶液中單增李斯特菌溶血素O的成孔活性，進而在體外篩選溶血素O的成孔抑制劑。
2.根據權利要求1所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素O抑制劑的方法，其特征在于，將蛋白標簽融合到溶血素O蛋白，然后通過標簽蛋白與底物的專一結合將FRET給-受體熒光小分子對分別共價標記到溶血素O，而后通過熒光小分子間的熒光共振能量轉移效應監控單增李斯特菌溶血素O的成孔活性，進而在體外篩選溶血素O的成孔抑制劑。
3.根據權利要求2所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素O抑制劑的方法，其特征在于，所述蛋白標簽融合到溶血素O蛋白的C端，其中，蛋白標簽可選自SNAP、Halo。
4.根據權利要求2所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素O抑制劑的方法，其特征在于，所述FRET給-受體熒光小分子對可為Cy3-Cy5、熒光素-羅丹明6G、Alexa488-Alexa555、Alexa488-Cy3、Aze-543染料。p>
5.根據權利要求1-4任意一項所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素O抑制劑的方法，其特征在于，
6.根據權利要求5所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素O抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟(5)分析光譜數據，首先計算熒光受體(A)與熒光給體(D)最大發射峰的比值IA/D，然后應用以下公式計算樣品抑制溶血素O成孔的抑制效率，進而得出單增李斯特菌溶血素O抑制劑，
7.根據權利要求4所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素O抑制劑的方法，其特征在于，所述篩選得出單增李斯特菌溶血素O抑制劑能夠抑制溶血素O的成孔。
8.一種根據權利要求1所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素O抑制劑的方法篩選出的抑制劑，其特征在于：結構如下圖所示
9.一種權利要求8所述的單增李斯特菌溶血素O抑制劑的應用，其特征在于：所述抑制劑在治療單增李斯特菌感染藥物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種體外篩選單增李斯特菌溶血素o抑制劑的方法，其特征在于，通過蛋白標簽法將具有熒光共振能量轉移效應的熒光小分子對分別標記到溶血素o，通過熒光小分子間的熒光共振能量轉移效應監控溶液中單增李斯特菌溶血素o的成孔活性，進而在體外篩選溶血素o的成孔抑制劑。
2.根據權利要求1所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素o抑制劑的方法，其特征在于，將蛋白標簽融合到溶血素o蛋白，然后通過標簽蛋白與底物的專一結合將fret給-受體熒光小分子對分別共價標記到溶血素o，而后通過熒光小分子間的熒光共振能量轉移效應監控單增李斯特菌溶血素o的成孔活性，進而在體外篩選溶血素o的成孔抑制劑。
3.根據權利要求2所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素o抑制劑的方法，其特征在于，所述蛋白標簽融合到溶血素o蛋白的c端，其中，蛋白標簽可選自snap、halo。
4.根據權利要求2所述的體外篩選單增李斯特菌溶血素o抑制劑的方法，其特征在于，所述fret給-受體熒光小分子對可為cy3-cy5、...
【專利技術屬性】
技術研發人員：徐兆超，苗露，段承恩，喬慶龍，許寧，
申請(專利權)人：中國科學院大連化學物理研究所，
類型：發明
國別省市：
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