【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及微生物，尤其涉及一種提高細菌的氨基酸生產能力的方法。
技術介紹
1、賴氨酸在飼料、醫藥、食品、化工等領域具有重要的應用價值，因此提高細菌生產賴氨酸的能力具有重要意義。谷氨酸棒桿菌是目前重要的賴氨酸生產菌。
2、為提高賴氨酸生產能力，對生產菌種的改造策略包括基于代謝路徑的理性改造、非理性的誘變和進化篩選等。目前賴氨酸的菌種改造主要集中在中心碳代謝途徑和賴氨酸終端代謝途徑。為進一步提升賴氨酸的生產效率，仍需要挖掘有利于細菌合成、積累賴氨酸的靶點。
技術實現思路
1、本專利技術提供一種提高細菌的氨基酸生產能力的方法。
2、本專利技術以開發高產賴氨酸的菌種為目的，在研發過程中發現，敲除ncgl1815基因能夠顯著促進賴氨酸的積累，提升菌株的賴氨酸生產能力。
3、基于上述發現，本專利技術提供以下技術方案：
4、第一方面，本專利技術提供ncgl1815基因或其同源基因、ncgl1815基因或其同源基因的抑制因子或ncgl1815基因或其同源基因的編碼蛋白的以下任一種應用：
5、(1)在構建用于生產賴氨酸或其衍生物的微生物中的應用；
6、(2)在微生物發酵生產賴氨酸或其衍生物中的應用；
7、(3)在提高微生物生產賴氨酸或其衍生物的產量中的應用。
8、ncgl1815基因是谷氨酸棒桿菌中編碼一種假定蛋白的基因，其編碼蛋白為含有重復lgfp的蛋白(lgfp?repeat-containing
9、具體而言，ncgl1815的同源基因是指其他株、種或屬的細菌中存在的與ncgl1815功能相似、具有較高同源性的基因。ncgl1815的同源基因與ncgl1815基因的編碼蛋白的相似性優選為至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％。
10、本專利技術中，所述基因的抑制因子是指能夠弱化基因表達的物質，這些物質包括核酸(例如sgrna、干擾rna等)、蛋白(例如阻遏蛋白等)、化合物等。
11、優選地，所述應用通過降低seq?id?no.1所示蛋白或其同源蛋白的表達量和/或酶活性實現。
12、本專利技術中，降低表達量和/或酶活性可通過以下(1)～(3)中的任意一種或多種方式實現：
13、(1)對所述基因進行突變以使其表達量降低；
14、(2)采用具有更低轉錄或翻譯活性的元件調控所述基因的轉錄或翻譯，使其表達量降低；
15、(3)對所述基因進行突變，使得其編碼蛋白的序列發生改變，以使得其編碼蛋白的酶活性降低。
16、上述降低可為弱化或失活。所述表達量和/或酶活性的降低為與修飾前相比，降低至少30％，至少50％，至少70％，至少90％或者完全喪失。
17、上述(1)中，所述突變可為將所述基因的起始密碼子突變為除atg以外的其它起始密碼子(例如：gtg或ttg)，或者對所述基因的編碼區進行一個或多個堿基的缺失、插入或替換，使得所述基因的表達量降低，甚至不再表達。
18、上述(2)中，具有更低活性是指與所述基因的原始轉錄或翻譯元件相比，活性更低。
19、其中，轉錄元件包括啟動子、增強子等；翻譯元件包括核糖體結合位點、5’-utr等。
20、優選地，以上所述的應用為通過失活微生物中的seq?id?no.1所示蛋白或其同源蛋白的編碼基因實現。
21、上述應用中，所述微生物為棒桿菌屬、埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬細菌。
22、優選地，所述微生物為棒桿菌屬細菌，更優選為谷氨酸棒桿菌。
23、本專利技術通過實驗驗證表明，在谷氨酸棒桿菌中失活ncgl1815基因，谷氨酸棒桿菌的賴氨酸產量顯著提高。
24、此外，本專利技術還發現，上述seq?id?no.1所示蛋白的改造可與醌依賴的l-乳酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉乙酰基酶中的一種或多種酶的表達量和/或酶活性降低的改造配合作用，進一步顯著提高賴氨酸產量，產生疊加的意外效果。
25、谷氨酸棒桿菌是好氧細菌，當環境中氧氣不充分時，會將部分碳源代謝生成有機酸，比如乙酸或乳酸，用以平衡細胞內的氧化還原狀態。谷氨酸棒桿菌中的乳酸代謝和乙酸代謝均有多個酶參與，并且受轉錄因子的調控，代謝反應較為復雜。乳酸脫氫酶主要參與生物體中乳酸的合成和分解代謝。谷氨酸棒桿菌中有三種形式的乳酸脫氫酶，其中，醌依賴的l-乳酸脫氫酶(lldd)，由ncgl2817編碼，可催化l-乳酸生成丙酮酸。谷氨酸棒桿菌中涉及乙酸的合成和代謝的也有多個酶促反應，其中，乙酸激酶(ack)由ncgl2656基因編碼，催化乙酸生成乙酰磷酸，并且反應是雙向的；磷酸轉乙酰基酶(pta)由ncgl2657基因編碼，催化乙酰磷酸生成乙酰輔酶a，并且反應也是雙向的。
26、優選地，所述應用還包括：降低微生物中選自醌依賴的l-乳酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉乙酰基酶中的一種或多種酶的表達量和/或酶活性。
27、在本專利技術的一些實施方式中，所述應用還包括降低微生物中的醌依賴的l-乳酸脫氫酶的表達量和/或酶活性。
28、在本專利技術的一些實施方式中，所述應用還包括降低微生物中的醌依賴的l-乳酸脫氫酶、乙酸激酶和磷酸轉乙酰基酶的表達量和/或酶活性。
29、優選地，上述表達量和/或酶活性降低通過失活所述酶的編碼基因實現。
30、對于谷氨酸棒桿菌而言，醌依賴的l-乳酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉乙酰基酶分別由ncgl2817、ncgl2656和ncgl2657基因編碼，其核苷酸序列分別如seq?id?no.3、4、5所示。
31、第二方面，本專利技術提供一種修飾的棒桿菌屬微生物，所述修飾的棒桿菌屬微生物中seq?id?no.1所示蛋白或其同源蛋白的表達量和/或酶活性降低。
32、優選地，所述修飾的棒桿菌屬微生物還包括以下修飾：選自醌依賴的l-乳酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉乙酰基酶中的一種或多種酶的表達量和/或酶活性降低。
33、以上所述的降低表達量和/或酶活性可通過以下(1)～(3)中的任意一種或多種方式實現：
34、(1)對所述基因進行突變以使其表達量降低；
35、(2)采用具有更低轉錄或翻譯活性的元件調控所述基因的轉錄或翻譯，使其表達量降低；
36、(3)對所述基因進行突變，使得其編碼蛋白的序列發生改變，以使得其編碼蛋白的酶活性降低。
37、上述降低可為弱化或失活。
38、上述(1)中，所述突本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.NCgl1815基因或其同源基因、NCgl1815基因或其同源基因的抑制因子或NCgl1815基因或其同源基因的編碼蛋白的以下任一種應用：
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用通過降低SEQ?ID?NO.1所示蛋白或其同源蛋白的表達量和/或酶活性實現。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述微生物為棒桿菌屬、埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬細菌。
4.根據權利要求1～3任一項所述的應用，其特征在于，所述應用還包括：降低微生物中選自醌依賴的L-乳酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉乙酰基酶中的一種或多種酶的表達量和/或酶活性。
5.一種修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，所述修飾的棒桿菌屬微生物中SEQ?IDNO.1所示蛋白或其同源蛋白的表達量和/或酶活性降低。
6.根據權利要求5所述的修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，所述修飾的棒桿菌屬微生物中，選自醌依賴的L-乳酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉乙酰基酶中的一種或多種酶的表達量和/或酶活性降低。
7.根據權利要求5或6所述的修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，
8.權利要求5～7任一項所述的修飾的棒桿菌屬微生物的構建方法，其特征在于，所述方法包括：修飾棒桿菌屬微生物以使得SEQ?ID?NO.1所示蛋白或其同源蛋白的表達量和/或酶活性降低。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述SEQ?ID?NO.1所示蛋白或其同源蛋白的表達量和/或酶活性降低通過失活其編碼基因實現。
10.一種發酵生產賴氨酸或其衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
...【技術特征摘要】
1.ncgl1815基因或其同源基因、ncgl1815基因或其同源基因的抑制因子或ncgl1815基因或其同源基因的編碼蛋白的以下任一種應用：
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述應用通過降低seq?id?no.1所示蛋白或其同源蛋白的表達量和/或酶活性實現。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述微生物為棒桿菌屬、埃希氏菌屬或芽孢桿菌屬細菌。
4.根據權利要求1～3任一項所述的應用，其特征在于，所述應用還包括：降低微生物中選自醌依賴的l-乳酸脫氫酶、乙酸激酶、磷酸轉乙酰基酶中的一種或多種酶的表達量和/或酶活性。
5.一種修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，所述修飾的棒桿菌屬微生物中seq?idno.1所示蛋白或其同源蛋白的表達量和/或酶活性降低。
6.根據權利...
【專利技術屬性】
技術研發人員：胡丹，王亞迪，馮帆，趙津津，李巖，
申請(專利權)人：廊坊梅花生物技術開發有限公司，
類型：發明
國別省市：
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