【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及rna結合蛋白質(rbp)分析，具體為同時鑒定rbp靶標和提供轉錄組信息的測序方法及應用。
技術介紹
1、rna水平的基因表達調控是許多生物過程的基礎，它復雜而精密地準確控制rna分子的生命周期。這類轉錄后調控主要是由細胞內部分蛋白質與rna以復雜的方式相互作用，組裝形成動態的核糖核蛋白顆粒(ribonucleoprotein?particles，rnps)以共同協調細胞命運、適應環境變化等一系列過程。rna結合蛋白(rna-binding?proteins，rbps)可以完整的參與rna轉錄后的不同生物階段，并與rrna、trna等組成分子機器，在基因表達調控網絡中扮演著樞紐的角色。然而許多rbp的功能與分子機制仍然是空白，導致rbp在發育以及疾病中的作用的研究進展緩慢。如今，越來越多的研究表明許多人類疾病，包括神經系統疾病、代謝性疾病以及癌癥，都與rbp功能障礙相關。目前鑒定到與疾病相關的rbp數量已經超過1000例，但是除了少數例外，人們極缺乏對rbp生理調控系統及病理性機制的理解。當疾病表型不能用rbp所熟知功能解釋時，找到它特異性識別哪些靶標，以rbp為核心檢測致病突變引發的相互作用發生異常，對于理解疾病發生過程至關重要。
2、目前研究rbp與rna的結合的前沿技術可以分為兩大類：第一種是依賴交聯與抗體的免疫沉淀方法；第二種是依賴rna加工酶的原位檢測方法。
3、rna免疫沉淀(rip)和交聯免疫沉淀(clip)是研究細胞內rna-蛋白質相互作用最基礎的技術，它們使用特定抗體來沉淀
4、最近，基于rna編輯的tribe和stamp被開發出來，這類方法利用異位表達的rbp-脫氨酶融合蛋白來標記rna底物。rna脫氨主要由兩類酶介導：作用于rna的腺苷脫氨酶(adars)和載脂蛋白b?mrna編輯酶胞嘧啶脫氨酶家族(也稱為aid/apobec家族)，分別負責a-to-i和c-to-u的編輯。adar結構是模塊化的，由雙鏈rna結合基序(dsrbms)和催化脫氨結構域(adarcd)組成，均可以獨立工作。adarcd將rna上的腺苷脫氨基為肌苷，被逆轉錄酶識別為鳥苷，因此通過rna測序可以確定a-g突變來識別adar編輯。內源adar編輯位點通常在非編碼區域alu重復元件中，因為它們偏向形成雙鏈rna特征。apobec1的rna結合能力微弱，在沒有伴侶蛋白apobec1偶聯因子(acf)存在的情況下無法編輯其底物，其編輯可能依賴c末端介導的同源二聚化。細胞內aopbec1編輯均存在結構和序列偏好性，幾乎都發生在3′utrs，偏向與au豐富的區域結合，序列上更偏好編輯5′-ac-3′。這些編輯酶的方法避免了靶標富集步驟，保留完整的轉錄組信息。雖然這些不需ip的技術允許從低投入材料(包括單細胞)中發現底物，但單個酶的使用可能造成假陰性結果，同時它們對基因操作的依賴限制了它們在原代細胞和臨床樣本中的應用。此外，異位表達的融合蛋白可能引入人為因素或干擾內源性蛋白的功能。最后，缺乏時間分辨率嚴重限制了它們研究動態生物過程的能力。
5、因此，為了充分理解rbp功能在不同環境下的調控作用，本領域迫切需要一種靈敏、通用且方便，能夠進行雙組學共同分析，具有高時間分辨率，僅需少量樣本輸入，并能應用于組織樣本的技術。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術提供了融合蛋白及其應用方法，可以同時鑒定rbp靶標和提供轉錄組信息，解決了現有技術中存在的問題。
2、在本專利技術的一個方面，提供了一種融合蛋白，該融合蛋白包括抗體結合結構域和rna編輯結構域，所述抗體結合結構域為pag結構域，包括protein?a和protein?g的功能結構域，所述rna編輯結構域包括大鼠apobec1酶脫氨結構域和/或人adar2酶脫氨結構域。
3、在本專利技術的一個具體實施方案中，所述融合蛋白包括所述pag結構域，和大鼠apobec1酶脫氨結構域和人adar2酶脫氨結構域。
4、在本專利技術的另一方面提供了使用本專利技術公開的融合蛋白同時鑒定rbp靶標和提供轉錄組信息的應用方法，所述方法包括以下步驟：
5、1.融合蛋白的表達純化：采用桿狀病毒表達載體系統進行表達和純化本專利技術的融合蛋白；
6、2.細胞/組織切片固定：利用甲醛溶液或3,3'-二硫代二丙酸二(n-羥基琥珀酰亞胺酯)(dsp)固定細胞/組織樣品；
7、3.細胞結合cona磁珠：用dpbs重懸固定后的細胞，加入cona磁珠，室溫旋轉孵育，結合完磁珠的細胞轉移至pcr管中；
8、4.抗體孵育：配制抗體孵育緩沖液，在實驗組和對照組中分別加入rbp抗體或igg的抗體緩沖液，重懸細胞，使用渦旋振蕩輕輕混勻，洗滌細胞后重懸；
9、5.脫氨酶的結合：提前配制含有本專利技術的融合蛋白的緩沖液，將步驟四中獲得的孵育完二抗的細胞洗滌重懸于含有融合蛋白的緩沖液中；
10、6.編輯反應啟動與終止：配制脫氨反應緩沖液，其中含有鋅離子用于啟動脫氨反應，將與本專利技術的融合蛋白共孵育的細胞洗滌后重懸于反應緩沖液中，以進行編輯反應；
11、7.rna提取與測序文庫構建：提取細胞總rna，進行建庫，檢測文庫濃度后，將庫中的cdna進行測序；
12、8.生物信息學分析：所述生物信息學分析包括數據質控、兩輪唯一比對、微調比對、鑒定單核苷酸變異(snvs)和差異編輯分析。
13、在本專利技術的一個實施方案中，在上述的步驟2中使用3,3'-二硫代二丙酸二(n-羥基琥珀酰亞胺酯)(dsp)來固定細胞。
14、在本專利技術的一個實施方案中，提供了本專利技術的融合蛋白用于鑒定rbp靶標和提供轉錄組信息的用途，其特征在于：其應用于組織樣本、冷凍切片或單細胞樣本中。
15、有益效果
16、本專利技術提供了同時鑒定rbp靶標和提供轉錄組信息的測序方法及應用。
17、與現有技術相比具備以下有益效果：
18、1、本專利技術公開的融合蛋白及其應用方法可以同時鑒定rbp靶標和提供轉錄組信息，利用本專利技術公開的技術方案，本專利技術人在hela細胞中成功鑒定了ythdf2和g3bp1等rbp的rna靶標，在hek293t細胞中檢測了ptbp1和g3bp1結合的轉錄本與結合基序，將本專利技術技術方案所得的內源蛋白結果與金標準clip-seq比較，結果充分驗證了本專利技術技術方案的實用性和靈敏性。...
【技術保護點】
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括抗體結合結構域和RNA編輯結構域，所述抗體結合結構域為pAG結構域，包括Protein?A和Protein?G的功能結構域，所述RNA編輯結構域包括大鼠APOBEC1酶脫氨結構域和/或人ADAR2酶脫氨結構域。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白包括所述pAG結構域，和大鼠APOBEC1酶脫氨結構域和人ADAR2酶脫氨結構域。
3.一種使用權利要求1的融合蛋白同時鑒定RBP靶標和提供轉錄組信息的方法，所述方法包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于在所述步驟2)中使用3,3'-二硫代二丙酸二(N-羥基琥珀酰亞胺酯)來固定細胞。
5.權利要求1所述的融合蛋白用于鑒定RBP靶標和提供轉錄組信息的用途，其特征在于：其應用于組織樣本、冷凍切片或單細胞樣本中。
【技術特征摘要】
1.一種融合蛋白，所述融合蛋白包括抗體結合結構域和rna編輯結構域，所述抗體結合結構域為pag結構域，包括protein?a和protein?g的功能結構域，所述rna編輯結構域包括大鼠apobec1酶脫氨結構域和/或人adar2酶脫氨結構域。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白包括所述pag結構域，和大鼠apobec1酶脫氨結構域和人adar2酶脫氨結構域...
【專利技術屬性】
技術研發人員：汪陽明，程玘軒，謝崗，張翔宇，肖俊宇，
申請(專利權)人：北京大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。