【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于多肽及多肽檢測，具體涉及一種定量多肽的篩選方法。
技術介紹
1、隨著居民生活水平的提高和消費習慣的改變，肉制品行業呈現出穩定增長的趨勢。但是近些年受原料肉的價格上下浮動較大的影響，一些不法商家為了降低成本，存在使用低價原料替代高價原料的現象，如在豬肉水餃中以低價的雞肉和鴨肉代替高價豬肉，或者，在牛肉丸中添加大量的低價豬肉以代替高價牛肉，但是這些原料的添加并不會真實地體現在配料表中，使得產品價格低于同類產品的市場價格，致合格的肉質品面臨不正當的競爭，不但影響企業的生存和發展，同時無法保證肉制品的安全。然而，目前并沒有相關方法能夠對肉制品中的物種進行準確地定量分析，導致監管部門無從監管。
2、蛋白質組學技術可以通過測定物種專屬性多肽進行物種定性分析，目前已廣泛應用至食品真實性判定分析中，但是無法實現物種的定量分析。目前一些研究是采用大海撈針式的策略從蛋白質定性分析數據中篩選定量多肽，這就需要通過從幾千甚至上萬條多肽中尋找定量多肽，步驟繁瑣、效率低下，使得目前蛋白定量技術未有大的突破，進而導致肉制品中物種的定量分析無法得以發展。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種定量多肽的篩選方法，所述篩選方法可以有效提高定量多肽的篩選效率，且方法簡便易操作。
2、本專利技術提供了一種定量多肽的篩選方法，包括如下步驟：
3、將待測樣品進行蛋白提取，得到蛋白提取液；
4、將所述蛋白提取液制備成不同濃度的蛋白提取液，并將所述不同濃度的
5、將所述凈化后的肽段進行高分辨質譜檢測，得到采集后的數據；
6、將所述采集后的數據進行定量蛋白質組分析，得到初篩定量多肽和蛋白；
7、將所述初篩定量多肽和蛋白進行多元統計分析，得到復篩定量多肽；
8、將所述復篩定量多肽進行blast物種特異性分析，得到復篩特異性定量多肽；
9、基于所述復篩特異性定量多肽和不同濃度的蛋白提取液進行prm數據采集，得到復篩特異性定量多肽的prm數據；
10、基于所述復篩特異性定量多肽的prm數據篩選所述復篩特異性定量多肽的響應值與所述蛋白提取液濃度呈現正相關的多肽，得到所述定量多肽。
11、優選的，所述定量蛋白質組分析包括非標記的定量蛋白質組分析。
12、優選的，所述多元統計分析包括：對所述初篩定量多肽和蛋白進行缺失值填充后進行標準化處理，并以標準化處理后的多肽數據進行層聚類分析，篩選依據物種含量的增加而呈現上升趨勢的多肽，得到所述復篩定量多肽。
13、優選的，所述不同濃度的蛋白提取液的體積濃度分別為5%、10%、25%、50%、75%和100%。
14、優選的，所述高分辨質譜檢測的色譜條件包括：色譜柱hypersil?gold?c18；柱溫40℃，進樣量10?μl；流動相包括a相和b相，所述a相為甲酸和水，所述a相中甲酸的體積濃度為0.1%，所述b相為甲酸和乙腈，所述b相中甲酸的體積濃度為0.1%；色譜梯度為0~0.2?min，3%~10%?b；0.2~16?min，10%~40%?b；16~17?min，40%~80%?b；17~19.5?min，80%?b；19.5~19.6min，80%~3%?b；19.6~25?min，3%?b；流速為0.2?ml/min；
15、所述高分辨質譜檢測的質譜條件包括：噴霧電壓3400?v；毛細管溫度320℃；鞘氣40?arb；輔助氣15?arb；全掃描分辨率120000，質量掃描范圍m/z?350~2000，自動增益值為3×106，注入時間為100?ms；二級掃描：topn為10，分辨率為30000，自動增益值為2×105，注入時間為50?ms，碰撞能量為30?v。
16、優選的，所述酶解使用的蛋白酶為胰蛋白酶。
17、優選的，所述凈化的方式包括固相萃取，所述固相萃取的萃取柱為c18固相萃取柱；所述固相萃取的活化條件包括：依次以乙腈、體積濃度為50%的乙腈水溶液、體積濃度為0.1%的三氟乙酸溶液活化c18固相萃取柱；所述固相萃取的洗脫條件包括依次使用體積濃度為0.1%三氟乙酸溶液和體積濃度為0.5%乙酸溶液洗脫后，再使用2?ml?體積濃度為60%的乙腈溶液和體積濃度為0.5%的乙酸溶液進行洗脫。
18、優選的，所述篩選所述復篩特異性定量多肽的響應值與所述蛋白提取液濃度呈現正相關的多肽使用的軟件包括skyline軟件。
19、有益效果：
20、本專利技術提供了一種定量多肽的篩選方法，所述篩選方法通過對待測樣品進行蛋白提取、酶解和凈化等前處理后，采用高分辨質譜進行數據采集，經定量蛋白質組分析后，將分析后的數據進行多元統計分析，對多元統計分析中的層聚類分析結果進行進一步的blast物種特異性分析和prm數據采集，篩選多肽響應值與待測樣品濃度呈正相關的系列多肽，進而得到定量多肽。相較于現有研究（中國專利zl?201910683954.?x）中的定量多肽的篩選方法，采用大海撈針式的策略從定性分析數據中先后通過物種唯一性篩選、多肽離子信息提取、儀器定量分析等方式篩選定量多肽而言，本專利技術通過多元統計分析的方式，可以排除80%的無效多肽，大大的提高了篩選效率。進一步通過blast物種特異性分析可以確認特異性多肽。此外，本專利技術對篩選的定量多肽進行prm數據分析，可以在不提供多肽離子信息的情況下，對初步篩選的定量多肽進行靶向定量數據采集，結合skyline軟件分析prm采集數據，可以對篩選的定量多肽再次進行線性分析，從而排除了質譜采集過程中不符合要求的多肽，快速篩選獲得有效的定量多肽。
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1.一種定量多肽的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述定量蛋白質組分析包括非標記的定量蛋白質組分析。
3.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述多元統計分析包括：對所述初篩定量多肽和蛋白進行缺失值填充后進行標準化處理，并以標準化處理后的多肽數據進行層聚類分析，篩選依據物種含量的增加而呈現上升趨勢的多肽，得到所述復篩定量多肽。
4.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述不同濃度的蛋白提取液的體積濃度分別為5%、10%、25%、50%和100%。
5.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述高分辨質譜檢測的色譜條件包括：色譜柱Hypersil?GOLD?C18；柱溫40?℃，進樣量10?μL；流動相包括A相和B相，所述A相為甲酸和水，所述A相中甲酸的體積濃度為0.1%，所述B相為甲酸和乙腈，所述B相中甲酸的體積濃度為0.1%；色譜梯度為0~0.2?min，3%~10%?B；0.2~16?min，10%~40%?B；16~17?min，40%~80%?B；17~19
6.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述酶解使用的蛋白酶為胰蛋白酶。
7.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述篩選所述復篩特異性定量多肽的響應值與所述蛋白提取液濃度呈現正相關的多肽使用的軟件包括Skyline軟件。
...【技術特征摘要】
1.一種定量多肽的篩選方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述定量蛋白質組分析包括非標記的定量蛋白質組分析。
3.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述多元統計分析包括：對所述初篩定量多肽和蛋白進行缺失值填充后進行標準化處理，并以標準化處理后的多肽數據進行層聚類分析，篩選依據物種含量的增加而呈現上升趨勢的多肽，得到所述復篩定量多肽。
4.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述不同濃度的蛋白提取液的體積濃度分別為5%、10%、25%、50%和100%。
5.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述高分辨質譜檢測的色譜條件包括：色譜柱hypersil?gold?c18；柱溫40...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張穎穎，康超娣，孔維恒，郭文萍，劉夢瑤，張明悅，齊婧，王娟強，王守偉，李瑩瑩，趙文濤，趙燕，
申請(專利權)人：中國肉類食品綜合研究中心，
類型：發明
國別省市：
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