【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及生物工程，尤其涉及一種修飾的棒桿菌屬微生物及其在賴(lài)氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、l-賴(lài)氨酸是堿性必需氨基酸，分子式為c6h14n2o2，外觀為白色或近乎于白色結(jié)晶粉末，在210℃變暗，在224.5℃下分解，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。l-賴(lài)氨酸廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料、醫(yī)藥和食品工業(yè)，用于動(dòng)物飼料添加劑，l-賴(lài)氨酸可促進(jìn)機(jī)體吸收其他氨基酸，從而提高飼料質(zhì)量。l-賴(lài)氨酸的市場(chǎng)需求量較大，因此提高l-賴(lài)氨酸的生產(chǎn)效率具有重要意義。
2、目前，l-賴(lài)氨酸最常用的生產(chǎn)方法為微生物發(fā)酵法，微生物發(fā)酵法具有原料成本低、反應(yīng)條件溫和、容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。谷氨酸棒桿菌(corynebacteriumglutamicum)是目前主要的l-賴(lài)氨酸生產(chǎn)菌。
3、谷氨酸棒桿菌中賴(lài)氨酸的合成以天冬氨酸為前體通過(guò)多步酶催化反應(yīng)得到，而草酰乙酸是天冬氨酸的合成前體，乙酰輔酶a和草酰乙酸結(jié)合形成檸檬酸進(jìn)入tca循環(huán)為細(xì)胞提供能量。乙酰輔酶a合成酶(acetyl-coa?synthetase，acs)是大腸桿菌中可催化乙酸鹽轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a的關(guān)鍵酶，而乙酰輔酶a是合成代謝和分解代謝途徑連接處的一種重要中間體。乙酰輔酶a合成酶催化兩步反應(yīng)，包括催化乙酸鹽與atp結(jié)合形成乙酰腺苷酸(acamp)中間體，以及將乙酰基從acamp轉(zhuǎn)移到coa的巰基，形成乙酰輔酶a。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)提供一種修飾的棒桿菌屬微生物及其在賴(lài)氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。
2、第一方
3、(1)在構(gòu)建用于生產(chǎn)賴(lài)氨酸或其衍生物的微生物中的應(yīng)用；
4、(2)在微生物發(fā)酵生產(chǎn)賴(lài)氨酸或其衍生物中的應(yīng)用；
5、(3)在提高微生物生產(chǎn)賴(lài)氨酸或其衍生物的產(chǎn)量中的應(yīng)用。
6、本專(zhuān)利技術(shù)中，所述乙酰輔酶a合成酶來(lái)源于含有乙酰輔酶a合成酶的微生物，包括但不限于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等。
7、優(yōu)選地，所述乙酰輔酶a合成酶為來(lái)源于大腸桿菌的乙酰輔酶a合成酶。
8、優(yōu)選地，所述微生物為棒桿菌屬細(xì)菌。更優(yōu)選為谷氨酸棒桿菌。
9、本專(zhuān)利技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在棒桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)異源乙酰輔酶a合成酶能夠促進(jìn)棒桿菌合成和積累賴(lài)氨酸，顯著提高其生產(chǎn)賴(lài)氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。
10、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述乙酰輔酶a合成酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
11、根據(jù)上述乙酰輔酶a合成酶的氨基酸序列和密碼子規(guī)則，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得所述乙酰輔酶a合成酶的編碼基因(acs)的核苷酸序列。由于密碼子簡(jiǎn)并性，乙酰輔酶a合成酶的編碼基因的核苷酸序列并不唯一，所有能夠編碼產(chǎn)生上述乙酰輔酶a合成酶的核苷酸序列均在本專(zhuān)利技術(shù)的保護(hù)范圍內(nèi)。
12、針對(duì)不同的微生物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以針對(duì)所要表達(dá)的乙酰輔酶a合成酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以使得該酶能夠在宿主微生物中較好地表達(dá)。密碼子優(yōu)化可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)。
13、在本專(zhuān)利技術(shù)的一些實(shí)施方式中，對(duì)于棒桿菌屬細(xì)菌(尤其是谷氨酸棒桿菌)，通過(guò)導(dǎo)入seq?id?no.2所示的編碼基因表達(dá)所述乙酰輔酶a合成酶。seq?id?no.2所示的編碼基因是根據(jù)谷氨酸棒桿菌的密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后的序列。
14、上述應(yīng)用中，所述生物材料包括表達(dá)盒、載體或宿主細(xì)胞。
15、其中，所述表達(dá)盒為將所述編碼基因與轉(zhuǎn)錄和/或翻譯調(diào)控元件可操作性地連接得到的重組核酸分子。
16、所述載體包括但不限于質(zhì)粒載體、病毒載體、轉(zhuǎn)座子。
17、所述宿主細(xì)胞為任意能夠攜帶所述編碼基因或表達(dá)所述乙酰輔酶a合成酶的細(xì)胞，包括微生物細(xì)胞，優(yōu)選為棒桿菌屬細(xì)菌(例如谷氨酸棒桿菌)、腸桿菌科細(xì)菌(例如大腸桿菌)或芽孢桿菌屬細(xì)菌(例如枯草芽孢桿菌)。
18、以上所述的應(yīng)用通過(guò)在棒桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)所述乙酰輔酶a合成酶實(shí)現(xiàn)。
19、以上所述的表達(dá)乙酰輔酶a合成酶可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)。
20、優(yōu)選地，所述表達(dá)乙酰輔酶a合成酶可通過(guò)以下(1)和/或(2)實(shí)現(xiàn)：
21、(1)增加染色體上乙酰輔酶a合成酶的編碼基因的拷貝數(shù)；
22、(2)導(dǎo)入具有乙酰輔酶a合成酶的編碼基因的質(zhì)粒。
23、在本專(zhuān)利技術(shù)的一些實(shí)施方式中，所述表達(dá)乙酰輔酶a合成酶通過(guò)在棒桿菌屬細(xì)菌染色體上插入乙酰輔酶a合成酶的編碼基因?qū)崿F(xiàn)。
24、本專(zhuān)利技術(shù)還發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)乙酰輔酶a合成酶的基礎(chǔ)上，失活棒桿菌屬內(nèi)源ncg11988基因或其同源基因能夠進(jìn)一步顯著提高賴(lài)氨酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。而且，表達(dá)乙酰輔酶a合成酶能夠與失活ncg11988基因或其同源基因協(xié)同作用，兩者同時(shí)改造對(duì)于賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力的提升作用效果明顯優(yōu)于兩者單獨(dú)改造。
25、優(yōu)選地，所述應(yīng)用還包括：失活棒桿菌屬細(xì)菌中的ncg11988基因或其同源基因。
26、ncg11988基因是谷氨酸棒桿菌中一個(gè)假定蛋白的編碼基因(其氨基酸序列如seqid?no.3所示，核苷酸序列如seq?id?no.4所示)，其功能尚不知曉，本專(zhuān)利技術(shù)發(fā)現(xiàn)失活ncg11988基因?qū)τ诰甑馁?lài)氨酸生產(chǎn)能力具有明顯的提升作用。基于ncg11988基因及其編碼蛋白的序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過(guò)同源序列檢索能夠確定其他棒桿菌屬細(xì)菌中該基因的同源基因。
27、以上所述的失活可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)，例如在所述基因中替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)堿基使得所述基因喪失功能。
28、在本專(zhuān)利技術(shù)的一些實(shí)施方式中，通過(guò)缺失所述基因的編碼框?qū)崿F(xiàn)其失活。
29、第二方面，本專(zhuān)利技術(shù)提供一種修飾的棒桿菌屬微生物，所述修飾的棒桿菌屬微生物表達(dá)乙酰輔酶a合成酶，和/或，所述修飾的棒桿菌屬微生物中ncg11988基因或其同源基因失活。
30、本專(zhuān)利技術(shù)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，在棒桿菌中，表達(dá)乙酰輔酶a合成酶或者失活ncg11988基因或其同源基因均能夠促進(jìn)賴(lài)氨酸的合成和積累，顯著提高菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力；同時(shí)進(jìn)行這兩種改造能夠進(jìn)一步提升菌株的賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力，實(shí)現(xiàn)更高的賴(lài)氨酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率。
31、優(yōu)選地，以上所述的乙酰輔酶a合成酶為來(lái)源于大腸桿菌的乙酰輔酶a合成酶。
32、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述乙酰輔酶a合成酶的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
33、以上所述的表達(dá)乙酰輔酶a合成酶可通過(guò)以下(1)和/或(2)實(shí)現(xiàn)：
34、(1)增加棒桿菌屬細(xì)菌染色體上乙酰輔酶a合成酶的編碼基因的拷貝數(shù)；
35、(2)在棒桿菌屬細(xì)菌中導(dǎo)入具有乙酰輔酶a合成酶的編碼基因的質(zhì)粒。
36、以上所述的失活可采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段實(shí)現(xiàn)，例如在所述基因中替換、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)堿基使得所述基因喪失功能。
37、在本專(zhuān)利技術(shù)的一些實(shí)施方式中，通過(guò)缺失所述基因的編碼框?qū)崿F(xiàn)其失活。
38、優(yōu)選地，所述修飾本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.乙酰輔酶A合成酶或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料的以下任一種應(yīng)用：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述乙酰輔酶A合成酶為來(lái)源于大腸桿菌的乙酰輔酶A合成酶；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用通過(guò)在棒桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)乙酰輔酶A合成酶實(shí)現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用還包括：失活棒桿菌屬細(xì)菌中的NCg11988基因或其同源基因。
5.一種修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，所述修飾的棒桿菌屬微生物表達(dá)乙酰輔酶A合成酶，和/或，所述修飾的棒桿菌屬微生物中NCg11988基因或其同源基因失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，所述乙酰輔酶A合成酶為來(lái)源于大腸桿菌的乙酰輔酶A合成酶；
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，所述修飾的棒桿菌屬微生物相比于修飾前的微生物具有增強(qiáng)的賴(lài)氨酸生產(chǎn)能力。
8.權(quán)利要求5～7任一項(xiàng)所述的修飾的棒桿菌屬微生物的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括：修飾棒桿菌屬微
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述表達(dá)乙酰輔酶A合成酶通過(guò)將SEQ?IDNO.2所示的基因?qū)氚魲U菌屬微生物實(shí)現(xiàn)。
10.權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述的修飾的棒桿菌屬微生物在發(fā)酵生產(chǎn)賴(lài)氨酸或其衍生物中的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括如下步驟：
...【技術(shù)特征摘要】
1.乙酰輔酶a合成酶或其編碼基因或含有所述編碼基因的生物材料的以下任一種應(yīng)用：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述乙酰輔酶a合成酶為來(lái)源于大腸桿菌的乙酰輔酶a合成酶；
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用通過(guò)在棒桿菌屬細(xì)菌中表達(dá)乙酰輔酶a合成酶實(shí)現(xiàn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用還包括：失活棒桿菌屬細(xì)菌中的ncg11988基因或其同源基因。
5.一種修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，所述修飾的棒桿菌屬微生物表達(dá)乙酰輔酶a合成酶，和/或，所述修飾的棒桿菌屬微生物中ncg11988基因或其同源基因失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的修飾的棒桿菌屬微生物，其特征在于，所述乙酰輔酶a...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王亞迪，胡丹，馮帆，趙津津，李巖，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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