【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，涉及一種穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株及其構建方法與應用。
技術介紹
1、腺病毒(adenovirus，ad)是一種雙鏈dna病毒，其基因組長度約35-40kb，目前已發現超過114個型別，分為7個亞群(a～g)。腺病毒已被廣泛地開發應用于疫苗載體及基因治療，其中以c亞群的ad5應用最為成熟。常用的腺病毒載體為e1和e3基因敲除的復制缺陷型載體，腺病毒e1區基因是其復制所必須的基因，e3區基因是對抗宿住免疫應答的關鍵基因。目前復制缺陷型腺病毒載體生產常用的細胞株是hek293，該細胞穩定表達腺病毒ad5?e1區的1-4344nt基因，對ad5的生長復制起到反式互補的作用。但該細胞株用于生產復制缺陷型ad5載體存在產生具有復制能力的腺病毒(rca)污染、生產效率低、比活低等不足。研究證明，腺病毒e3區主要編碼5個蛋白產物，其中adp基因主要功能是促進細胞裂解，促使病毒釋放和傳播。基于adp具備促進細胞裂解的生物學功能，在溶瘤病毒研究中，被嘗試重新重組到e3敲除的ad5載體，并利用a549細胞可正常生產擴增。也有研究將ad5、ad41等的adp基因插回腺病毒e3區，獲得的復制型腺病毒載體可在293te32等細胞系改善病毒生長。然而現有技術策略均將adp回補至病毒載體基因組本身，且僅在復制型腺病毒載體進行研究，也未進行adp對腺病毒生產影響的直接實驗比較。而且，前期策略需對每個應用的病毒載體進行單獨改造，存在多啟動子、降低載量等弊端，應用存在限制，需要開發更普遍適用于產業化的提升復制缺陷型腺病毒產量策
2、因此，有必要開發一種可以提高復制缺陷型腺病毒載體產量和比活的細胞株。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株及其構建方法與應用，與hek293細胞相比較，該衍生細胞株可以促進復制缺陷型ad5載體噬斑形成，提高復制缺陷型ad5載體拷貝數，提升復制缺陷型ad5載體比活，可應用于ad5載體疫苗的生產，提高產量，降低產業化成本，具備轉化應用價值。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、在本專利技術的第一方面，提供了一種穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株，所述細胞株的保藏編號為gdmcc?no.65235。
4、在本專利技術的第二方面，提供了所述的穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株的構建方法，所述方法包括：
5、獲得adp基因片段，通過hindiii+noti酶切后，與同樣酶切的pegfp-n1載體連接，得到pas1-5adp質粒；
6、將靶向aavs1的sgrna退火合成雙鏈片段與px330載體通過bbsi酶切后的載體片段進行連接，轉化獲得px330-aavsi質粒；
7、將所述pas1-5adp質粒和所述px330-aavsi質粒共轉染hek293細胞，后經過含嘌呤霉素培養基壓力篩選和挑選鑒定，獲得所述的穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株。
8、進一步地，所述adp片段是以ad5基因組為模板、序列seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的引物進行pcr獲得的。
9、進一步地，所述adp基因片段的核苷酸序列如seq?id?no.5所示，氨基酸序列如seqid?no.6所示。
10、進一步地，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no.3-seq?id?no.4所示。
11、進一步地，所述含嘌呤霉素培養基壓力篩選包括：
12、所述pas1-5adp質粒和所述px330-aavsi質粒共轉染hek293細胞16-18h后換成含10％fbs的dmem，24-25h后換含嘌呤霉素培養基壓力篩選細胞，同時設置對照孔，對照孔的hek293細胞不轉染；
13、當所述對照孔的hek293細胞幾乎全部死亡時，對所述共轉染孔hek293細胞進行傳代，并持續用含嘌呤霉素的dmem培養基壓力篩選，用有限稀釋法挑取單克隆細胞，經過多輪單克隆的挑選。
14、在本專利技術的第三方面，提供了所述的穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株在生產復制缺陷型ad5載體疫苗中的應用。
15、本專利技術實施例中的一個或多個技術方案，至少具有如下技術效果或優點：
16、1、與hek293細胞相比較，本申請的穩定表達5型腺病毒adp的hek293衍生細胞株(293-adp)，可以促進復制缺陷型ad5載體噬斑形成，提高復制缺陷型ad5載體拷貝數，提高復制缺陷型ad5疫苗的滴度進而提升復制缺陷型ad5載體比活，可應用于復制缺陷型ad5載體疫苗的生產，提高產量，降低產業化成本，具備轉化應用價值。
17、2、本申請的穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株用于復制缺陷型ad5載體疫苗或ad5基因治療載體的生產，產量比同等條件下的hek293細胞株高，若用于工業化生產中可降低復制缺陷型ad5載體生產成本，具有顯著的經濟價值。
18、本專利技術的穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株的保藏日期為2024年10月10日，保藏編號為gdmcc?no.65235，分類學名稱為人胚胎腎臟細胞(hek293)293-adp。保藏單位名稱為廣東省微生物菌種保藏中心，地址為中國廣東省廣州市廣東省科學院微生物研究所，郵編：510075。
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1.一種穩定表達腺病毒ADP的HEK293衍生細胞株，其特征在于，所述細胞株的保藏編號為GDMCC?No.65235。
2.一種權利要求1所述的穩定表達腺病毒ADP的HEK293衍生細胞株的構建方法，其特征在于，所述方法包括：
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述ADP片段是以Ad5基因組為模板、序列SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的引物進行PCR獲得的。
4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述ADP基因片段的核苷酸序列如SEQID?NO.5所示。
5.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ?IDNO.3-SEQ?ID?NO.4所示。
6.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述pX330載體片段是pX330載體通過bBSI酶切后獲得。
7.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述含嘌呤霉素培養基壓力篩選包括：
8.權利要求1所述的穩定表達腺病毒ADP的HEK293衍生細胞株在制備復制缺陷型Ad5載體疫苗
9.權利要求1所述的穩定表達腺病毒ADP的HEK293衍生細胞株在制備基因治療產品中的應用。
10.一種復制缺陷型Ad5載體疫苗，其特征在于，所述復制缺陷型Ad5載體疫苗為利用權利要求1所述的穩定表達腺病毒ADP的HEK293衍生細胞株進行生產獲得。
...【技術特征摘要】
1.一種穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株，其特征在于，所述細胞株的保藏編號為gdmcc?no.65235。
2.一種權利要求1所述的穩定表達腺病毒adp的hek293衍生細胞株的構建方法，其特征在于，所述方法包括：
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述adp片段是以ad5基因組為模板、序列seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的引物進行pcr獲得的。
4.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述adp基因片段的核苷酸序列如seqid?no.5所示。
5.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq?idno.3...
【專利技術屬性】
技術研發人員：馮穎，陳凌，羅嘉銘，孫欣欣，余長發，段子淵，
申請(專利權)人：廣州國家實驗室，
類型：發明
國別省市：
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