【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥檢測，具體涉及一種破傷風抗體效價測定方法。
技術介紹
1、破傷風是由破傷風桿菌侵入人體傷口造成的一種特異性感染，是致死性傳染病，其高毒力的痙攣毒素可阻斷中樞神經系統的抑制性神經遞質，引起肌肉強直和典型的全身痙攣。抗體效價是疾病診斷、特異性免疫球蛋白制備和疫苗評價等領域的重要指標，具有十分重要的作用。通過檢測破傷風抗體效價，可以評估疫苗接種后個體的免疫保護水平，判斷疫苗的有效性。測定破傷風抗體效價可以幫助了解自然感染后個體的免疫狀態，評估其對再次感染的抵抗力。
2、目前破傷風抗體效價的檢測方法包括：
3、中和試驗法：將稀釋的血清與破傷風毒素混合，然后加入敏感的小鼠或細胞系，觀察毒素的致死效應或細胞病變效應(cpe)，計算中和抗體的效價。但是該方法需要較長的孵育時間，通常需要幾天時間才能得出結果。實驗結果受多種因素影響，如小鼠的敏感性、細胞系的狀態等，可能導致結果的不一致性。
4、酶聯免疫吸附試驗(elisa)：通過檢測血清中特異性破傷風抗體與固定在固相載體上的破傷風抗原的結合能力，間接反映抗體的效價。但是該方法試劑盒成本高，且存在一定的假陽性或假陰性的概率，需要進一步確認，此外elisa操作步驟較多，需要精確的加樣和洗滌步驟，容易出現操作誤差。
5、比濁法：通過測量抗體與抗原結合后形成的免疫復合物的濁度變化來評估抗體的效價。但是該方法靈敏度相對較低，可能無法檢測到低效價的抗體；且比濁法的特異性相對較差，可能受到非特異性免疫復合物的干擾。
6、因此，亟
技術實現思路
1、本專利技術意在提供一種破傷風抗體效價測定方法，以實現破傷風抗體效價的快速、準確檢測。
2、為達到上述目的，本專利技術采用如下技術方案：一種破傷風抗體效價測定方法，包括如下步驟：
3、步驟一、標準品稀釋；
4、步驟二、待測樣品稀釋；
5、步驟三、加樣及孵育，加入r1試劑、樣品/標準品后孵育，并測定吸光度值a1；
6、步驟四、孵育完成后，加入r2試劑后孵育，并測定吸光度值a2；
7、步驟五、計算吸光度差值△a＝a2-a1，整理標準品吸光度值，利用統計軟件擬合吸光度-效價函數，并根據擬合函數測算破傷風抗體的含量。
8、優選的，作為一種改進，步驟三中，在570nm/700nm波長下測量吸光度值a1。
9、優選的，作為一種改進，步驟三中，孵育的條件為在37℃反應盤中孵育5min。
10、優選的，作為一種改進，步驟四中，r1試劑和r2試劑在使用前室溫放置30min。
11、本技術方案中，r1和r2為破傷風免疫血漿效價測試試劑盒中兩種試劑，包括稀釋液(由緩沖液、表面活性劑、促濁劑、防腐劑組成)、工作液(由緩沖液、包被破傷風疫苗類毒素原液的乳膠顆粒、無關蛋白、防腐劑組成)。
12、優選的，作為一種改進，步驟四中，在570nm/700nm波長下測量吸光度值a2。
13、優選的，作為一種改進，步驟四中，孵育的條件為在37℃反應盤中孵育5min。
14、優選的，作為一種改進，步驟五中，引起明顯濁度變化的最高稀釋度，即為破傷風抗體的效價。
15、本方案的原理及優點是：實際應用時，針對現有技術中在檢測破傷風抗體效價時，存在的重復性和準確度差的問題，本技術方案中，在檢測破傷風抗體效價時，基于比濁法，其原理在于：依據在高分子膠乳顆粒的表面交聯單克隆抗原，讓其在含有促聚劑的緩沖液中與待測抗體發生特異性結合，形成免疫復合物。這些復合物的顆粒大小和數量會隨著抗體效價的不同而有所變化。通過使用全自動生化分析儀檢測反應體系中形成的免疫復合物所導致的濁度變化來定量分析抗體的效價。濁度的增加與免疫復合物的生成量成正比，而免疫復合物的生成量又與抗體的濃度和效價相關。通過建立標準曲線，將待測樣本的濁度值與已知效價的標準品進行比較，從而確定待測樣本中破傷風抗體的效價。
16、破傷風抗原與血清中的破傷風抗體特異性結合，形成免疫復合物。免疫復合物的形成會導致溶液的濁度增加，通過測量濁度的變化來評估抗體的效價。
17、在技術研發期間，本技術方案放棄了生化分析儀不明確的定標和計算方式，打破了現有的法定方法以及儀器既有的定標和計算方式，創造性的將破傷風人免疫球蛋白國家標準品作為定標品在生化分析儀上進行定標后使用破傷風抗體檢測試劑溶液測定供試品的破傷風抗體效價，結果計算時，全部讀取吸光度值，在excel完成曲線擬合和計算，使檢測陽光化。檢測時長約30min，單批次成本約500元/批，多批次成本約300元/批，可實現快速準確測定供試品的效價，且成本遠遠低于小鼠法。(在破傷風抗體效價測定實驗中，目前采用藥典規定的小鼠法，實驗所需的耗材包括國家標準品、毒素、小鼠、飼料、墊料、滅菌水等。檢測一批次供試品的成本約2000元/批，多批次同時開展時成本為1800元/批。同時需要5天時間完成檢測。)在此過程中，標準品、待測樣品的稀釋倍數的確定是本技術方案的關鍵點之一：摸索階段發現原方法(標準品的濃度為：0iu/ml，2.5iu/ml，5iu/ml，10iu/ml，20iu/ml，30iu/ml，檢測范圍在0-30iu/ml，相關系數r＞0.99。檢測方法：免疫比濁法。主波長：578nm，副波長：700nm，定標方法：四參數。反應方向：正向。r1試劑150μl；r2試劑50μl。測定方法(兩點終點法)：150μl稀釋液加入2μl樣本，于37℃反應5分鐘，讀點測得吸光度a1，然后加入50μl工作液，于37℃反應5分鐘之后再次讀點測得吸光度a2，計算吸光度差值，并根據破傷風標準曲線計算定測試結果)檢測高效價樣品時由于稀釋倍數大導致檢測結果的重復性和準確度差，故考慮用經過標定的樣品作曲線，擬合一條適用于檢測高濃度樣品的曲線，以降低樣品的稀釋倍數，但是該方法受限于樣品的保存、結果的可靠性，遂摒棄。
18、綜上：本技術方案的有益效果在于：本技術方案使用破傷風人免疫球蛋白國家標準品作為定標品作標準曲線，具有準確可靠的數據來源，檢測結果穩定可靠。本法節約成本的同時符合動物福利倫理，減少人員使用破傷風毒素的生物安全風險。
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1.一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：步驟三中，在570nm/700nm波長下測量吸光度值A1。
3.根據權利要求2所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：步驟三中，孵育的條件為在37℃反應盤中孵育5min。
4.根據權利要求3所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：R1試劑和R2試劑在使用前室溫放置30min。
5.根據權利要求4所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：步驟四中，在570nm/700nm波長下測量吸光度值A2。
6.根據權利要求5所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：步驟四中，孵育的條件為在37℃反應盤中孵育5min。
7.根據權利要求6所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：步驟五中，引起明顯濁度變化的最高稀釋度，即為破傷風抗體的效價。
【技術特征摘要】
1.一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：步驟三中，在570nm/700nm波長下測量吸光度值a1。
3.根據權利要求2所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：步驟三中，孵育的條件為在37℃反應盤中孵育5min。
4.根據權利要求3所述的一種破傷風抗體效價測定方法，其特征在于：r1試劑和r2試劑在使用前...
【專利技術屬性】
技術研發人員：何小鋒，龔志明，張寶獻，郭心怡，楊柳，
申請(專利權)人：華蘭生物工程重慶有限公司，
類型：發明
國別省市：
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