【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及從生物樣品中消除宿主核酸的方法。
技術(shù)介紹
1、快速而全面的傳染病診斷對于改善患者管理和對抗殺菌劑耐藥性是至關(guān)重要。快速診斷危及生命的傳染病(諸如敗血癥和肺炎)是至關(guān)重要的。這些臨床綜合征具有復(fù)雜的病因并且需要在具有挑戰(zhàn)性的樣品基質(zhì)(諸如血液、痰等)中識別病原體。目前，用于臨床診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法是微生物培養(yǎng)，其是勞動密集型的，具有長的周轉(zhuǎn)時間和差的臨床靈敏度。目前可用的快速分子方法(例如pcr)改善了結(jié)果的周轉(zhuǎn)時間和靈敏度，但受范圍限制，而且由此罕見的病原體和抗性標(biāo)志物可能是有問題的。用于快速檢測微生物病原體的最適用的技術(shù)是核酸擴(kuò)增試驗(naat)。naat可用于敗血癥診斷(例如septifast(rtm)、roche)，但使用的復(fù)雜性和次優(yōu)的性能阻止了它們的廣泛采用。大多數(shù)用于呼吸道感染(rti)的naat專注于檢測呼吸道病毒(例如biofire?filmarray?respiratory?panel，seegenerv15)。curetis?unyvero(rtm)試驗是一個例外，該試驗專為醫(yī)療保健相關(guān)肺炎而設(shè)計。然而，naat并不全面(例如，curetis試驗僅涵蓋90％的排名靠前的病原體)，僅尋求預(yù)先設(shè)定的靶標(biāo)范圍，這意味著將錯過不太常見的病原體。因此，naat診斷是標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)的輔助手段，而非替代手段，并且采用率有限。
2、迫切需要診斷技術(shù)的范式轉(zhuǎn)變-一種可以檢測任何病原體(例如病毒、細(xì)菌、真菌)和抗生素抗性的通用診斷方法。不可知/霰彈槍宏基因組測序有可能成為推動這種轉(zhuǎn)變的首選技術(shù)。霰彈槍宏基
3、那么為什么霰彈槍宏基因組學(xué)目前還沒有廣泛應(yīng)用于感染診斷？一個原因是下一代測序(ngs)傳統(tǒng)上是昂貴的，執(zhí)行復(fù)雜且難以分析。minion(rtm)納米孔測序技術(shù)的發(fā)展通過廉價的便攜式測序儀、快速簡單的文庫制備(15分鐘)和自動化實時分析工具改變了ngs領(lǐng)域。另一個主要障礙是臨床樣品中存在大量人類dna，其通常比存在的病原體dna高幾個數(shù)量級。由于存在大量人類與病原體核酸(特別是dna)(基于106個白細(xì)胞/ml，比率通常為108：1至109：1[有～6.6pg?dna/細(xì)胞]但每毫升的病原體少至1-10個菌落形成單位[cfu][含～10fg?dna/細(xì)胞])，血液是基于ngs的病原體表征的特別具有挑戰(zhàn)性的基質(zhì)。至少約105的宿主dna消除，可能使得人類：病原體dna比率為103：1，是促進(jìn)基于ngs的病原體表征所必需的，消除水平(引起病原體核酸富集)通過本領(lǐng)域公開的方法(諸如市售的病原體dna富集方法(looxster(rtm)富集試劑盒(analytic?jena)；nebnext(rtm)微生物群系dna富集試劑盒(neb)；molysis(rtm)基礎(chǔ)5試劑盒(molzym)))是未實現(xiàn)的。
4、本專利技術(shù)的目的之一是解決上述問題。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、因此，提供了用于消除生物樣品中的宿主核酸的方法，所述樣品先前已經(jīng)從動物宿主獲得，所述方法包括以下步驟：
2、(a)向所述樣品中加入溶細(xì)胞素或其活性變體；和
3、(b)進(jìn)行將從所述樣品內(nèi)宿主細(xì)胞釋放的核酸物理消除，或者以其他方式使這種核酸不可識別的過程。
4、優(yōu)選地，步驟(b)包括向所述樣品中添加核酸酶和/或該方法進(jìn)一步包括從樣品中提取剩余核酸的步驟。
5、優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括使所提取的核酸經(jīng)歷純化過程的步驟和/或進(jìn)一步包括擴(kuò)增所提取的核酸的步驟。
6、優(yōu)選地，該方法進(jìn)一步包括對所提取的核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增試驗的步驟，或者優(yōu)選地，對所提取的核酸進(jìn)行測序過程。
7、在優(yōu)選的實施方案中，溶細(xì)胞素是磷脂酶，優(yōu)選磷脂酶c(plc)，更優(yōu)選是細(xì)菌的plc，更優(yōu)選是第1組plc，最優(yōu)選是來自產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridium?perfringens)的plc。
8、在優(yōu)選的實施方案中，生物樣品是血液樣品。
9、在優(yōu)選的實施方案中，該方法引起樣品中最初包含的宿主dna的至少10倍、優(yōu)選至少102倍、優(yōu)選至少103倍、優(yōu)選至少104倍、最優(yōu)選至少105倍的消除。
10、還提供了試劑盒，其包含i)溶細(xì)胞素或其活性變體，和ii)物理消除生物樣品中的游離核酸或以其他方式使得這種核酸不可識別的工具。優(yōu)選地，所述溶細(xì)胞素如上所定義，和/或其中，所述工具包含核酸酶。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.消除血液樣品中宿主核酸的方法，所述樣品先前已從人類宿主獲得，所述方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括從所述樣品中提取剩余的核酸的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括使所提取的核酸經(jīng)歷純化過程的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括擴(kuò)增所提取的核酸的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括對所提取的核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增試驗的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括對所提取的核酸進(jìn)行測序過程的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)菌的磷脂酶D是來自鏈霉菌屬(Streptomyces)的磷脂酶D。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述細(xì)菌的磷脂酶C是來自酒紅鏈霉菌(Streptomyces?vinaceus)的磷脂酶D。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其產(chǎn)生初始包含在所述樣品內(nèi)的宿主DNA的至少10倍的消除。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其產(chǎn)生初始包含在所述樣品內(nèi)的宿主DNA的至少102倍的消除。<...
【技術(shù)特征摘要】
1.消除血液樣品中宿主核酸的方法，所述樣品先前已從人類宿主獲得，所述方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括從所述樣品中提取剩余的核酸的步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括使所提取的核酸經(jīng)歷純化過程的步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括擴(kuò)增所提取的核酸的步驟。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括對所提取的核酸進(jìn)行核酸擴(kuò)增試驗的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進(jìn)一步包括對所提取的核酸進(jìn)行測序過程的步驟。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)菌的磷脂酶d是來自鏈霉菌屬(streptomyces)的磷脂酶d。
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：賈斯汀·約瑟夫·奧格雷迪，約翰·理查德·韋恩，所羅門·姆韋格維西亞，杰瑪·路易絲·凱，
申請(專利權(quán))人：東安格利亞大學(xué)企業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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