【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物分子生物學及基因工程，尤其涉及一種smsnr基因及其在提高丹參中丹酚酸含量的應用。
技術介紹
1、丹參(salvia?miltiorrhiza?bge.)為唇形科鼠尾草屬多年生草本植物，始載于漢代的《神農百草經》，其味苦，性微寒，以干燥的根和根莖入藥。丹參作為我國栽培最為廣泛的大宗藥材之一，具有祛瘀止痛、活血通經等功效，被廣泛應用于心絞痛、急性腦梗、冠心病等多種心腦血管疾病的治療，具有廣泛的臨床應用前景。丹酚酸類物質是丹參中發揮活血化瘀功效的主要成分，近年來還發現具有抗腫瘤、抗炎、抗菌抗病毒、清除自由基等多種藥理活性，具有極高的藥用價值。丹參作為重要的藥食同源物種，目前已被開發出了多種保健食品，如丹參茶、丹參天麻膠囊，丹參氨基軟骨素片等，這些產品具有活血化瘀、調節血脂、增加骨骼密度等功效，具有廣闊的市場價值。
2、但是近年來，由于丹參種質資源的嚴重退化，不同產區丹參藥材丹酚酸含量參差不齊，品質差異較大。因此，穩定地提高丹參中的藥用成分含量具有重要的研究意義和應用前景。通過基因工程在丹參中敲除或者過表達轉錄因子，是從遺傳學角度改良丹參的品質，提高丹參中藥用成分的含量。根據以往的相關報道，myb家族轉錄因子在丹酚酸生物合成中具有重要的作用，但是不同的轉錄因子可能對丹酚酸的合成會產生不同的影響。smmyb52可以激活丹酚酸生物合成中的關鍵酶基因，正向調控丹酚酸的積累，但smmyb36具有相反的功能，過表達smmyb36會抑制丹參毛狀根中丹酚酸的積累。因此，為了實際解決丹參種質低下及解決丹參中丹酚酸含量低下
技術實現思路
1、為了克服現有技術中存在的至少一個問題，本專利技術提供一條響應赤霉素刺激的smsnr基因及其提高丹參中丹酚酸含量的應用。本專利技術通過赤霉素刺激丹參，篩選到了響應赤霉素誘導的丹參myb家族轉錄因子-smsnr，通過在丹參中敲除smsnr基因可以激活丹酚酸下游合成途徑中的關鍵酶基因的表達來顯著提高丹參中丹酚酸含量的積累，上述方法很好地解決了丹參種質低下、丹參中丹酚酸含量低下等問題。
2、為實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、本專利技術的第一個方面是提供一種smsnr基因，其響應赤霉素刺激調控丹酚酸生物合成，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、進一步地，用于pcr擴增smsnr基因的引物序列如seq?id?no.10～seq?id?no.11所示。
5、進一步地，用于qrt-pcr檢測smsnr基因的引物序列如seq?id?no.12～seq?idno.13所示。
6、進一步地，用于構建含有smsnr基因序列的亞細胞定位載體的引物序列如seq?idno.14～seq?id?no.15所示。優選，所述亞細胞定位載體為含有smsnr目的序列的peaq-smsnr-gfp載體。
7、本專利技術的第二個方面是提供一種第一個方面中任一所述的smsnr基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
8、本專利技術的第三個方面是提供一種與敲除smsnr基因有關的生物材料，其包括：smsnr基因序列的sgrna序列、含有sgrna序列的重組載體、敲除smsnr基因序列的重組載體、敲除smsnr基因序列的重組細胞。
9、上述生物材料中，分析smsnr基因的開放閱讀框區域尋找smsnr的潛在的sgrna，其優選的sgrna序列如seq?id?no.3所示。上述生物材料中，載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體，載體可通過轉化、轉導或轉染宿主細胞，宿主細胞包括原核細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、動物細胞等，例如大腸桿菌、根癌農桿菌等。上述重組載體、重組細胞系均可采用本領域常規方法制備。優選的，含有sgrna序列的重組載體為含sgrna序列的crispr/cas9-at中間載體，敲除smsnr基因序列的重組載體為pcambia1300-smsnrsgrna-crispr/cas9載體，敲除smsnr基因序列的重組細胞為敲除smsnr的根癌農桿菌。
10、本專利技術的第四個方面是一種如第一個方面中任一所述的smsnr基因、或如第三個方面中任一所述的生物材料在提高丹參中丹酚酸含量的應用，其通過在丹參中定向敲除smsnr基因來提高丹參中丹酚酸的含量。
11、進一步地，通過敲除丹參中的smsnr基因提高丹參合成途徑中關鍵酶基因的表達，所述關鍵酶基因包括smpal、smtat、smc4h、sm4cl、smhppr、smras、smcyp98a75、smcyp98a78，優選所述關鍵酶基因為smpal和smras。
12、進一步地，所述丹酚酸包括丹酚酸b和迷迭香酸。
13、進一步地，采用crispr/cas9方法在丹參中定向敲除smsnr基因。
14、進一步地，所述在丹參中定向敲除smsnr基因的步驟具體包括：：
15、步驟s1、根據smsnr基因序列設計sgrna序列，并將sgrna序列整合至含有crispr/cas9表達框的中間載體中；
16、步驟s2、對步驟s1中獲得的含有sgrna序列的中間載體進行雙酶切，并將酶切產物連接構建到植物表達載體中，以獲得敲除載體；
17、步驟s3、將步驟s2中獲得的敲除載體轉化到根癌農桿菌感受態細胞中，獲得含有敲除載體的根癌農桿菌菌株；
18、步驟s4、將步驟s3轉化獲得的根癌農桿菌菌株侵染丹參無菌苗外植體，以獲得丹參smsnr基因敲除毛狀根。
19、進一步地，所述步驟s1中，所述sgrna序列如seq?id?no.3所示。
20、進一步地，所述步驟s1中，所述含有crispr/cas9表達框的中間載體為crispr/cas9-at載體。具體地，所述crispr/cas9-at載體由atu6啟動子驅動表達，在構建過程中使用的酶切位點為bbsⅰ。
21、進一步地，所述步驟s1中，將sgrna序列整合至含有crispr/cas9表達框的中間載體中所使用的引物序列如seq?id?no.4～seq?id?no.5所示。
22、進一步地，所述步驟s1中，所述crispr/cas9-at載體的構建步驟為：使用t4?pnk酶對如seq?id?no.4～seq?id?no.5所示序列的引物進行引物退火；使用bbsⅰ對crispr/cas9-at進行單酶切；使用全式金的t4連接酶將sgrna序列整合至crispr/cas9-at中間載體中。
23、進一步地，所述步驟s1中，所述退火體系為10×t4?pnk?buffer?1μl、t4polynucleotide?kinase?0.5μl、正反向引物各1μl、ddh2o?6.5μl；反應條件為37℃水浴30min，pcr：95℃，5min，隨后每隔30sec降5℃，直至降到25℃；所述單酶切體系為crispr/cas9-a本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種SmSNR基因，其特征在于，所述SmSNR基因響應赤霉素刺激調控丹酚酸生物合成，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
2.一種由權利要求1所述的SmSNR基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。
3.一種與敲除SmSNR基因有關的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括：SmSNR基因序列的sgRNA序列、含有sgRNA序列的重組載體、敲除SmSNR基因序列的重組載體、敲除SmSNR基因序列的重組細胞系。
4.一種如權利要求1所述的SmSNR基因、或如權利要求3所述的生物材料在提高丹參中丹酚酸含量的應用，其特征在于，通過在丹參中定向敲除SmSNR基因來提高丹參中丹酚酸的含量。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述在丹參中定向敲除SmSNR基因的步驟具體包括：
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述步驟S1中，所述sgRNA序列如SEQ?IDNo.3所示；和/或，
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述步驟S1中，將sgRNA序列整合至
8.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述步驟S2中，所述植物表達載體為pCAMBIA?1300植物表達載體，所述敲除載體為pCAMBIA1300-SmSNRsgRNA-CRISPR/Cas9載體；和/或，
9.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述步驟S4中，還包括對丹參毛狀根進行PCR鑒定及測序確定SmSNR基因成功敲除的步驟；其中，對毛狀根的基因組DNA進行PCR鑒定使用的引物序列如SEQ?ID?No.6～SEQ?ID?No.7所示；對毛狀根的rolB基因進行PCR鑒定使用的引物序列如SEQ?ID?No.8～SEQ?ID?No.9所示。
10.一種丹參SmSNR基因敲除毛狀根的構建方法，其特征在于，所述構建方法采用如權利要求5～9中任一所述的在丹參中定向敲除SmSNR基因的步驟。
...【技術特征摘要】
1.一種smsnr基因，其特征在于，所述smsnr基因響應赤霉素刺激調控丹酚酸生物合成，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種由權利要求1所述的smsnr基因編碼的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
3.一種與敲除smsnr基因有關的生物材料，其特征在于，所述生物材料包括：smsnr基因序列的sgrna序列、含有sgrna序列的重組載體、敲除smsnr基因序列的重組載體、敲除smsnr基因序列的重組細胞系。
4.一種如權利要求1所述的smsnr基因、或如權利要求3所述的生物材料在提高丹參中丹酚酸含量的應用，其特征在于，通過在丹參中定向敲除smsnr基因來提高丹參中丹酚酸的含量。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述在丹參中定向敲除smsnr基因的步驟具體包括：
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述步驟s1中，所述sgrna序列如seq?idno.3所示；和/或，
7.根據權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周正，韓翠翠，何穎，余璐瑤，邢小雯，王蕓，郝鍇，
申請(專利權)人：中國人民解放軍海軍特色醫學中心，
類型：發明
國別省市：
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