【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，涉及番茄紅素環化酶突變體蛋白及其制備方法和應用。
技術介紹
1、類胡蘿卜素是一類廣泛存在于自然界中的天然色素，具有重要的生物學功能和廣泛的應用價值。這些色素不僅賦予植物、藻類和一些微生物鮮艷的顏色，還在光合作用中發揮重要作用，并且具有抗氧化、增強免疫功能等多種健康效益。因此，類胡蘿卜素在食品、醫藥、化妝品等行業中有著廣泛的應用需求。
2、mva途徑是ipp(isopentenyl?pyrophosphate)和dmapp(dimethylallylpyrophosphate)合成的途徑之一。在mva途徑中，乙酰輔酶a通過乙酰coa-酰基轉移酶(acetyl-coa?acetyltransferase，atob)、3-羥基-3-甲基戊二酰coa合酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl?coa?synthase，erg13)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl?coa?reductase，hmg1)、甲羥戊酸激酶(mevalonate?kinase，erg12)、磷酸甲羥戊酸激酶(phosphomevalonatekinase，erg8)和甲羥戊酸二磷酸脫羧酶(mevalonatediphosphate?decarboxylase，mvd1)的催化作用合成ipp。異戊烯基焦磷酸異構酶(isopentenyl?diphosphate?isomerase，idi)催化ipp生成同分異構體dmapp。erg20和ggs為同功能酶，均屬
3、carrp，其全稱為雙功能番茄紅素環化酶/八氫番茄紅素合成酶，是一種雙功能酶，其含有兩個功能性結構域，即位于n端的carrp-r(具有番茄紅素環化酶活性)和位于c端的carrp-p(具有八氫番茄紅素合成酶活性)。carrp-p負責將兩個分子的ggpp合成為八氫番茄紅素(phytoene)。八氫番茄紅素在八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene?desaturase，carb)作用下生成番茄紅素。番茄紅素在carrp-r作用下環化形成γ-胡蘿卜素(γ-carotene)和β-胡蘿卜素(β-carotene)。β-胡蘿卜素在β-胡蘿卜素酮基化酶(β-carotene?ketolase，crtw)及β-胡蘿卜素羥基化酶(β-carotene?hydroxylase，crtz)作用下合成角黃素、玉米黃素和蝦青素等類胡蘿卜素。carrp在類胡蘿卜素合成中起著至關重要的作用。然而，目前天然類胡蘿卜素的生產效率較低，難以滿足工業生產的需求。
4、為了提高類胡蘿卜素的生產效率，研究人員已嘗試通過基因工程手段對carrp進行改造，以增強其催化活性和產量。其中，對carrp的番茄紅素環化酶功能結構域進行突變，是提高類胡蘿卜素合成效率的一個潛在策略。
技術實現思路
1、本專利技術旨在通過對carrp的番茄紅素環化酶功能結構域的特定氨基酸進行定點飽和突變，篩選出能夠顯著提高目標物(角黃素和β-胡蘿卜素)合成效率的突變體蛋白。
2、本專利技術提供了番茄紅素環化酶突變體蛋白及其制備方法和應用。
3、本專利技術提供了一種突變體蛋白(番茄紅素環化酶的突變體蛋白)，命名為carrp-r突變體蛋白，是將突變前蛋白中的目標位點的氨基酸突變為其他氨基酸得到的；所述突變前蛋白具有seq?id?no：5中第1至239位所示的區段；所述目標位點位于seq?id?no：5的第98位。所述carrp-r突變體蛋白是將所述突變前蛋白中的目標位點的氨基酸由精氨酸突變為其他氨基酸得到的。具體的，所述突變前蛋白如seq?id?no：5中第1至239位所示。具體的，所述突變前蛋白為野生型番茄紅素環化酶。
4、本專利技術還提供了一種突變體蛋白(雙功能番茄紅素環化酶/八氫番茄紅素合成酶的突變體蛋白)，命名為carrp突變體蛋白，是將突變前蛋白中的目標位點的氨基酸突變為其他氨基酸得到的；所述突變前蛋白具有seq?id?no：5所示的區段；所述目標位點位于seqid?no：5的第98位。所述carrp突變體蛋白是將突變前蛋白中的目標位點的氨基酸由精氨酸突變為其他氨基酸得到的。具體的，所述突變前蛋白如seq?id?no：5所示。具體的，所述突變前蛋白為野生型雙功能番茄紅素環化酶/八氫番茄紅素合成酶。
5、具體的，以上任一所述其他氨基酸為堿性氨基酸、中性氨基酸或酸性氨基酸。
6、具體的，以上任一所述其他氨基酸為脂肪族氨基酸、雜環氨基酸或芳香族氨基酸。
7、具體的，以上任一所述其他氨基酸為丙氨酸、組氨酸、酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
8、本專利技術還保護編碼所述carrp-r突變體蛋白的基因。
9、具體的，所述基因為如下(c1)或(c2)或(c3)：
10、(c1)編碼區如seq?id?no：3中第1-717位所示的dna分子；
11、(c2)與(c1)具有95％以上同一性的dna分子；
12、(c3)在嚴格條件下與(c1)雜交的dna分子。
13、上述嚴格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。
14、本專利技術還保護編碼所述carrp突變體蛋白的基因。
15、具體的，所述基因為如下(d1)或(d2)或(d3)：
16、(d1)編碼區如seq?id?no：3所示的dna分子；
17、(d2)與(d1)具有95％以上同一性的dna分子；
18、(d3)在嚴格條件下與(d1)雜交的dna分子。
19、上述嚴格條件可為用0.1×sspe(或0.1×ssc)，0.1％sds的溶液，在dna或者rna雜交實驗中65℃下雜交并洗膜。
20、本專利技術還保護具有以上任一所述基因的表達盒、dna分子、重組載體或重組微生物。
21、具體的，所述表達盒中由ptefin啟動子啟動所述基因轉錄且由thmg1終止子終止所述基因轉錄。
22、具體的，具有所述基因的dna分子為供體dna分子。具體的，所述供體dna分子自上游至下游依次具有l-arm、所述表達盒和r-arm。l-arm為上游同源臂，r-arm為下游同源臂。上游同源臂和下游同源臂用于將所述表達盒整合至目標位點。具體的，所述目標位點為intc3位點。所述l本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種突變體蛋白，是將突變前蛋白中的目標位點的氨基酸突變為其他氨基酸得到的；所述突變前蛋白具有SEQ?ID?NO：5中第1至239位所示的區段；所述目標位點位于SEQ?IDNO：5的第98位。
2.一種突變體蛋白，是將突變前蛋白中的目標位點的氨基酸突變為其他氨基酸得到的；所述突變前蛋白具有SEQ?ID?NO：5所示的區段；所述目標位點位于SEQ?ID?NO：5的第98位。
3.如權利要求1或2所述的突變體蛋白，其特征在于：所述其他氨基酸為丙氨酸、組氨酸、酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
4.編碼權利要求1至3中任一所述突變體蛋白的基因。
5.具有權利要求4所述基因的表達盒、DNA分子、重組載體或重組微生物。
6.生物材料在制備產品中的應用；
7.權利要求1或3所述突變體蛋白作為番茄紅素環化酶的應用。
8.權利要求2或3所述突變體蛋白作為雙功能番茄紅素環化酶/八氫番茄紅素合成酶的應用。
9.生物材料在制備類胡蘿卜素中的應用；
10.如權利要求6或9所述的應用，其特征在于：所述類胡蘿
...【技術特征摘要】
1.一種突變體蛋白，是將突變前蛋白中的目標位點的氨基酸突變為其他氨基酸得到的；所述突變前蛋白具有seq?id?no：5中第1至239位所示的區段；所述目標位點位于seq?idno：5的第98位。
2.一種突變體蛋白，是將突變前蛋白中的目標位點的氨基酸突變為其他氨基酸得到的；所述突變前蛋白具有seq?id?no：5所示的區段；所述目標位點位于seq?id?no：5的第98位。
3.如權利要求1或2所述的突變體蛋白，其特征在于：所述其他氨基酸為丙氨酸、組氨酸、酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸。
【專利技術屬性】
技術研發人員：張學禮，李清艷，洪浩然，樊飛宇，
申請(專利權)人：中國科學院天津工業生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：
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