【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物檢測，具體地，涉及一種高穩定性的pdgf-bb活性檢測方法。
技術介紹
1、重組人血小板源性生長因子(platelet-derived?growth?factor，pdgf)是一種可刺激結締組織增生的常見肽類調節因子，由兩條不同的多肽鏈組成，由二硫鍵連接成二聚體，二聚體不同的組合形成三個異構體即pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-ab。其中，pdgf-aa是由兩個a鏈組成的同源二聚體，具有促進細胞增殖、存活和遷移的作用。pdgf-bb是由兩個b鏈組成的同源二聚體，在心臟缺血再灌注損傷模型中發揮有益的心臟保護作用。pdgf-ab是由一個a鏈和一個b鏈組成的異源二聚體，具有結合并激活pdgfrα和pdgfrβ受體的能力。
2、pdgf-bb有助于細胞生長、血管生成和血管發育，可調節成、破骨細胞及促進骨愈合，突顯了其在協調組織穩態所需的基本生理過程中的重要性。重組蛋白的活性檢測，是產品質量檢測的一個關鍵參數，活性有無和優劣直接關系到產品能否放行銷售、能否滿足臨床應用或是基礎研究的使用需求。目前市場上提供的pdgf-bb定量活性檢測方法多使用balb/c?3t3及nih/3t3細胞，細胞選擇較為單一，而且檢測方法極其不穩定，極大地增加了對該因子活性的批間一致性的評價難度。因此，目前本領域亟需開發一種全新的穩定性好、操作簡單、能夠同時快速進行多批次pdgf-bb活性檢測的方法。
3、目前，尚未見使用atdc5細胞評價pdgf-bb活性的相關研究或報道。
技術實現思
1、為了克服目前本領域存在的上述技術問題，本專利技術的目的在于提供一種高穩定性的pdgf-bb活性檢測方法，所述方法是一種基于atdc5細胞的pdgf-bb活性檢測方法，方法穩定性好，操作簡單，可同時快速進行多批次pdgf-bb的活性檢測，克服了目前現有技術中存在的pdgf-bb定量活性檢測方法多使用balb/c?3t3及nih/3t3細胞，細胞選擇較為單一，而且檢測方法極其不穩定這一技術問題，本專利技術提供的方法為本領域以期提供質量有保障、批次穩定的pdgf-bb蛋白奠定了基礎。
2、本專利技術采用如下技術方案實現上述專利技術目的：
3、本專利技術的第一方面提供了一種高穩定性的pdgf-bb活性檢測方法。
4、進一步，所述方法包括：采用atdc5細胞檢測pdgf-bb的生物學活性。
5、進一步，所述方法包括如下步驟：
6、(1)收集atdc5細胞，進行細胞饑餓；
7、(2)將pdgf-bb樣品及參比品進行稀釋；
8、(3)將經稀釋后的pdgf-bb樣品及參比品加入到步驟(1)所得的atdc5細胞中，進行培養；
9、(4)加入發光法3d細胞活力檢測試劑，避光振蕩后避光孵育，進行化學發光檢測，根據測定的發光值擬合四參數曲線確定pdgf-bb的生物學活性。
10、進一步，步驟(1)中所述的atdc5細胞鋪板密度為6×104/ml；
11、可選地，采用完全培養基制備atdc5細胞懸液；
12、可選地，每孔加入細胞懸液體積為100μl；
13、可選地，所述atdc5細胞的培養條件為：37℃、co2培養箱中培養17h；
14、可選地，所述完全培養基的配方為：dmem:ham's?f12(1:1)、fbs、ps(100×)；
15、可選地，所述完全培養基中各組分的含量分別為：98％?dmem:ham'sf12(1:1)、1％fbs、1％?ps(100×)。
16、進一步，步驟(1)中所述的細胞饑餓包括：培養atdc5細胞17h后，棄去完全培養基，加入1×dpbs，短暫停留后棄去1×dpbs，加入維持液，進行細胞饑餓培養；
17、可選地，所述1×dpbs的加入量為：每孔100μl；
18、可選地，所述維持液的加入量為：每孔100μl；
19、可選地，所述饑餓培養的條件為：37℃、co2培養箱中饑餓24h；
20、可選地，所述維持液的配方為：dmem:ham's?f12(1:1)、fbs、ps(100×)；
21、可選地，所述維持液中各組分的含量分別為：98％?dmem:ham's?f12(1:1)、1％fbs、1％ps(100×)。
22、進一步，步驟(3)中所述的經稀釋后的pdgf-bb樣品或參比品的加入量為：每孔100μl；
23、可選地，所述atdc5細胞為棄去所述維持液的atdc5細胞；
24、可選地，所述培養的條件為：37℃、co2培養箱中培養72h。
25、進一步，步驟(4)中所述的發光法3d細胞活力檢測試劑為celltiter-lumitm?3d細胞活力檢測試劑、celltiter-3d細胞活力檢測試劑或luminescent?3d細胞活力檢測試劑；
26、可選地，所述發光法3d細胞活力檢測試劑的加入量為：每孔100μl；
27、可選地，避光振蕩的條件為：室溫避光500rpm振蕩5min；
28、可選地，避光孵育的條件為：室溫避光孵育5min；
29、可選地，采用多功能酶標儀進行化學發光檢測。
30、在本專利技術中，所述pdgf-bb是指血小板衍生生長因子-bb(platelet-derivedgrowth?factor-bb)的縮寫，屬于pdgf家族。pdgf-bb是由兩個b鏈通過二硫鍵連接形成的同源二聚體。pdgf-bb主要來源于血小板的α顆粒。當血管受到損傷時，血小板被激活并聚集在損傷部位，隨后釋放出包括pdgf-bb在內的多種生長因子。此外，多種細胞如平滑肌細胞、活化的巨噬細胞等也能夠合成和分泌pdgf-bb。
31、在本專利技術中，所述atdc5細胞是一種來源于小鼠畸胎瘤細胞at805的軟骨細胞系。atdc5細胞在體外表現出連續的表型轉變，包括從間充質凝結到鈣化的各個階段。骨形態發生蛋白-2(bmp-2)可以刺激atdc5細胞早期和晚期分化，甲狀旁腺激素(pth)/pth相關肽(pthrp)受體的激活可以抑制這種分化能力。在胰島素刺激下，atdc5細胞能夠分化成軟骨細胞，形成軟骨小結，并表達ⅱ型膠原和x型膠原，最后發生礦化，完整地反映了軟骨發生過程。由于atdc5細胞具有明確的軟骨發生特性，被廣泛認為是研究軟骨發育過程中細胞行為影響因素的理想體外模型。
32、在一些實施方案中，本專利技術對所述atdc5細胞的具體來源并無特別限制，將任何商品化的atdc5細胞或任何自行構建的atdc5細胞用于pdgf-bb活性檢測中的相關應用均將落入本專利技術的保護范圍內。
33、在本專利技術中，所述發光法3d細胞活力檢測是一種基于生物發光原理對3d培養細胞的活力進行定量檢測的技術，具有高靈敏度、高穩定性等特點。其檢測原理如下：細胞內的三磷酸腺苷(atp)是細胞能量的直接來源，在活細本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高穩定性的PDGF-BB活性檢測方法，其特征在于，所述方法包括：采用ATDC5細胞檢測PDGF-BB的生物學活性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的ATDC5細胞鋪板密度為6×104/mL；
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的細胞饑餓包括：培養ATDC5細胞17h后，棄去完全培養基，加入1×DPBS，短暫停留后棄去1×DPBS，加入維持液，進行細胞饑餓培養；
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的經稀釋后的PDGF-BB樣品或參比品的加入量為：每孔100μL；
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的發光法3D細胞活力檢測試劑為CellTiter-LumiTM?3D細胞活力檢測試劑、3D細胞活力檢測試劑或Luminescent?3D細胞活力檢測試劑；
7.一種高穩定性的PDGF-BB活性檢測試劑，其特征在于，所述試劑包含ATDC5細胞、PDG
8.一種高穩定性的PDGF-BB活性檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求7所述的試劑。
9.權利要求1-6中任一項所述的方法在PDGF-BB蛋白質量控制中的應用。
10.ATDC5細胞在高穩定性的檢測PDGF-BB活性中的應用；
...【技術特征摘要】
1.一種高穩定性的pdgf-bb活性檢測方法，其特征在于，所述方法包括：采用atdc5細胞檢測pdgf-bb的生物學活性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的atdc5細胞鋪板密度為6×104/ml；
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的細胞饑餓包括：培養atdc5細胞17h后，棄去完全培養基，加入1×dpbs，短暫停留后棄去1×dpbs，加入維持液，進行細胞饑餓培養；
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述的經稀釋后的pdgf-bb樣品或參比品的加入量為：每孔100μ...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王展鵬，喬倩，王立燕，
申請(專利權)人：北京同立海源生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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