【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物檢測領域，具體涉及復制型逆轉錄病毒的檢測。
技術介紹
1、隨著病毒分子生物學，結構生物學的發展，人們對病毒的更深入的認識為基因治療提供了穩定的理論基礎，并且促成了病毒載體在臨床研究中的廣泛應用。γ-逆轉錄病毒載體是第一個進入臨床研究的病毒載體，對病毒載體在基因治療的應用的可行性及安全性進行了評估。截至2012年，仍有2/3的臨床試驗用到了病毒載體，其中逆轉錄病毒載體占到了19.7％。其中，γ-逆轉錄病毒載體是一類rna病毒，其中的許多野生型病毒都具有致病性，如murine?leukaemia?virus和feline?leukaemia?virus等，因此對在基因治療產品中使用的病毒載體的安全性應當進行評估。
2、一個重要的考慮是由于逆轉錄病毒可將外源基因整合進入細胞基因組中，可能引起插入突變(insertional?mutagenesis)，使得細胞基因序列發生改變并長期影響細胞基因表達，如整合位點位于原癌基因附近的細胞基因表達的上調可以改變細胞生長，影響宿主細胞基因型和表型的改變和導致內源性病毒的激活。在基因治療重癥免疫系統缺陷綜合征scid-x1中，有報道逆轉錄病毒載體基因整合至lmo2原癌基因啟動子附近導致lmo2表達紊亂和細胞不受控制的增殖，并且這些整合是非隨機的；在基因治療x染色體連鎖慢性肉芽腫x-cgd中部分病人發生了白血病或骨髓增生異常，這些事件促使了更安全的逆轉錄病毒載體設計的發展，如自失活γ逆轉錄病毒載體sin-γrv的設計。但復制缺陷型自失活逆轉錄病毒載體含有病毒感染和運送基因
3、由于使用γ-逆轉錄病毒載體進行臨床試驗的增多，歐洲藥品管理局ema于2003年歐盟委員會指令2003/63/ec對病毒安全性進行了要求，包括安全性評估，要求患者樣本及最終藥品具有可追溯性，非復制型病毒液中不含可復制型病毒，監控患者在接收治療的全程及之后出現的可能感染及相關的后遺癥，監控與患者頻繁接觸者如醫護人員。2006年美國食品與藥品監管局fda發布了對基于逆轉錄病毒載體的基因治療產品rcr檢測的指導意見，文件詳細地推薦了相關檢測方法，生產過程需要檢測rcr的內容及檢驗量，并在2018年發布了新的指導文件草案，仍對rcr檢測有明確的要求。我國國家食品藥品監督管理總局cfda在2017年發布了《細胞治療產品研究與評價技術指導原則》(試行)，對于采用基因修飾的細胞治療產品，要求關注有復制能力的病毒產生(replication-competent?viruses，rcv)和插入突變，特別是致癌基因的活化。在其生產質量評估階段可對rcv形成風險進行評估，并應對其導致的插入突變風險進行評價，相關法律法規及指導性文件正在逐步完善。綜合考慮相關法律法規及指導文件的要求，我們主要參考fda發布的相關指導文件進行rcr檢測方法的開發與方法驗證。
技術實現思路
1、本專利技術提供一種用于檢測樣品中是否存在復制型逆轉錄病毒的引物組，其特征在于，所述引物組的正向引物與seq?id?no:1具有至少或約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，所述引物組的反向引物與seq?id?no:2具有至少或約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
2、在一個或多個實施方案中，所述引物組的正向引物與seq?id?no:1具有或約90％、90.9％、95％、95.2％或100％的同一性；所述引物組的反向引物與seq?id?no:2具有或約91.3％、92％、95.7％、95.8％或100％的同一性。
3、在一個或多個實施方案中，所述引物組還包括探針，所述探針與seq?id?no:3具有不低于85％的同一性。在一個或多個實施方案中，所述探針與seq?id?no:3具有或約有86.7％、88.2％、93.3％、93.8％或100％的同一性。
4、本專利技術還提供如上任一實施方案所述的引物組在制備檢測樣品中是否存在復制型逆轉錄病毒的試劑中的應用。
5、在一個或多個實施方案中，所述檢測基于聚合酶鏈反應(pcr)的方法。在一個或多個實施方案中，所述pcr的方法選自普通pcr(一代pcr)、實時熒光定量pcr(quantitativereal-time?pcr,qpcr)、實時熒光定量逆轉錄pcr(real-time?rt-pcr,rt-qpcr)和數字pcr(digital?pcr,dig-pcr,dpcr)。在一個或多個實施方案中，所述實時熒光定量pcr為嵌合熒光染料法或熒光探針法。在一個或多個實施方案中，所述熒光染料法采用的是飽和熒光染料或非飽和熒光染料。在一個或多個實施方案中，所述熒光染料法采用的熒光染料是sybrgreenⅰ、eva?green、lc?green或pico?green等。在一個或多個實施方案中，所述熒光探針法選自taqman探針法、分子信標探針法、mgb探針法和lightcycler探針法。
6、在一個或多個實施方案中，所述逆轉錄病毒是γ-逆轉錄病毒。在一個或多個實施方案中，所述γ-逆轉錄病毒含有galv包膜。在一個或多個實施方案中，所述逆轉錄病毒是以長臂類人猿白血病病毒(gibbon?ape?leukemia?virus，galv)包膜蛋白為包膜的γ-逆轉錄病毒。
7、在一個或多個實施方案中，所述樣品是基因組dna或cdna。在一個或多個實施方案中，所述樣品是cdna。在一個或多個實施方案中，所述基因組dna或cdna來自于所述逆轉錄病毒的宿主細胞，所述宿主細胞可生產所述逆轉錄病毒。在一個或多個實施方案中，所述逆轉錄病毒的宿主細胞為hek293細胞。
8、本專利技術還提供一種用于檢測樣品中是否存在復制型逆轉錄病毒的試劑盒，所述試劑盒包含如上任一實施方案所述的引物組。
9、在一個或多個實施方案中，所述引物組單獨地或混合地儲存于容器(例如ep管)中。
10、在一個或多個實施方案中，所述引物組中的引物是固態或液態的。
11、在一個或多個實施方案中，所述試劑盒還包含pcr反應體系的常規成分。在一個或多個實施方案中，所述pcr反應體系的常規成分選自dntps、pcr反應緩沖液和dna聚合酶。在一個或多個實施方案中，所述試劑盒還包含用于qpcr的熒光探針，在某些實施方案中，所述熒光探針法選自taqman探針、分子信標探針、mgb探針和lightcycler探針。
12、在一個或多個實施方案中，所述試劑盒包含逆轉錄病毒宿主細胞(可生產所述病毒的細胞)，在一個或多個實施方案中，所述逆轉錄病毒宿主細胞為hek293細胞。
13、在一個或多個實施方案中，所述試劑盒包含目的基因或片段的拷貝數或濃度已知的標準品。...
【技術保護點】
1.一種用于檢測樣品中是否存在復制型逆轉錄病毒的引物組，其特征在于，所述引物組的正向引物與SEQ?ID?NO:1具有不低于90％的同一性，所述引物組的反向引物與SEQ?IDNO:2具有不低于90％的同一性。
2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組的正向引物與SEQ?ID?NO:1具有或約有90％、90.9％、95％、95.2％或100％的同一性，所述引物組的反向引物與SEQ?IDNO:2具有或約有91.3％、92％、95.7％、95.8％或100％的同一性；或所述引物組還包括探針，所述探針與SEQ?ID?NO:3具有不低于85％的同一性，優選地，所述探針與SEQ?ID?NO:3具有或約有86.7％、88.2％、93.3％、93.8％或100％的同一性。
3.權利要求1所述的引物組在制備檢測樣品中是否存在逆轉錄病毒的試劑中的應用，所述逆轉錄病毒含有GaLV包膜或是以長臂類人猿白血病病毒(Gibbon?Ape?LeukemiaVirus，GALV)包膜蛋白為包膜的γ-逆轉錄病毒。
4.一種用于檢測樣品中是否存在復制型逆轉錄病毒的試劑
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含qPCR反應體系的常規成分，如dNTPs、PCR反應緩沖液或DNA聚合酶。
6.一種檢測樣品中是否存在復制型逆轉錄病毒的方法，其特征在于，所述方法使用了如權利要求1或2所述的引物組。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是基于聚合酶鏈反應(PCR)的方法；優選地，所述PCR的方法選自普通PCR(一代PCR)、實時熒光定量PCR(QuantitativeReal-time?PCR,qPCR)、實時熒光定量逆轉錄PCR(Real-time?RT-PCR,RT-qPCR)和數字PCR(Digital?PCR,Dig-PCR,dPCR)；更優選地，所述PCR的方法為實時熒光定量PCR。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述實時熒光定量PCR為嵌合熒光染料法或熒光探針法；優選地，所述熒光探針法選自TaqMan探針法、分子信標探針法、MGB探針法和LightCycler探針法。
9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述逆轉錄病毒是γ-逆轉錄病毒，優選地，所述γ-逆轉錄病毒含有GaLV包膜或是以長臂類人猿白血病病毒(Gibbon?ApeLeukemia?Virus，GALV)包膜蛋白為包膜的γ-逆轉錄病毒。
10.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述樣品為免疫細胞治療產品，所述免疫細胞治療產品在制備或生產過程中使用或接觸過含有GaLV包膜的γ-逆轉錄病毒；優選地，所述免疫細胞治療產品為CAR-T、TCR-T、CAR-NK、CAR-NKT或CAR-M產品。
...【技術特征摘要】
1.一種用于檢測樣品中是否存在復制型逆轉錄病毒的引物組，其特征在于，所述引物組的正向引物與seq?id?no:1具有不低于90％的同一性，所述引物組的反向引物與seq?idno:2具有不低于90％的同一性。
2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述引物組的正向引物與seq?id?no:1具有或約有90％、90.9％、95％、95.2％或100％的同一性，所述引物組的反向引物與seq?idno:2具有或約有91.3％、92％、95.7％、95.8％或100％的同一性；或所述引物組還包括探針，所述探針與seq?id?no:3具有不低于85％的同一性，優選地，所述探針與seq?id?no:3具有或約有86.7％、88.2％、93.3％、93.8％或100％的同一性。
3.權利要求1所述的引物組在制備檢測樣品中是否存在逆轉錄病毒的試劑中的應用，所述逆轉錄病毒含有galv包膜或是以長臂類人猿白血病病毒(gibbon?ape?leukemiavirus，galv)包膜蛋白為包膜的γ-逆轉錄病毒。
4.一種用于檢測樣品中是否存在復制型逆轉錄病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1或2所述的引物組。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含qpcr反應體系的常規成分，如dntps、pcr反應緩沖液或dna聚合酶。
6.一種檢測樣品中是否存在復...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊艷梅，魏潔瓊，趙威，
申請(專利權)人：上海恒潤達生生物科技股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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