【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程領域。具體而言，本專利技術涉及一種模塊化的基因編輯工具及其應用。更具體而言，本專利技術提供了可以對生物體的基因組核苷酸序列進行精準編輯的模塊化的基因編輯工具蛋白，包含所述模塊化的基因編輯工具蛋白的堿基編輯系統以及利用所述蛋白或系統進行基因編輯的方法。使用該編輯工具可以實現多種類型的精準核苷酸序列編輯。
技術介紹
1、基因編輯可以對生物體的遺傳信息進行精準修飾，已經成為生命科學領域的一項顛覆性技術，被應用于生物醫藥開發、基因工程治療、作物遺傳改良、生態環境保護等眾多方向。
2、早期基因編輯技術以鋅指核酸酶(zinc-finger?nucleases,zfn)和轉錄激活因子樣效應因子核酸酶(transcription?activator-like?effector?nuclease,talen)技術為代表，它們通過蛋白質與核酸的相互作用實現對于靶標基因的定位和編輯。2012年，基于成簇規律間隔短回文重復(clustered?regularly?interspaced?short?palindromicrepeats,crispr)序列的基因編輯技術被開發出來，此后因為該系統具有操作簡單，編輯效率高的特點而迅速被領域內的研究人員所應用。其原理是，在一段稱為sgrna的小rna序列的引導下，核酸內切酶cas蛋白定位到目標dna位點執行切割功能并引發dna雙鏈斷裂(double-strand?break,dsb)，進而激活細胞內的如非同源末端連接(non-homologous?endjoining,nhe
3、為實現更精準的基因編輯，2016年，不依賴于dsb的堿基編輯(base?editing)和堿基編輯系統(base?editor)被開發出來。堿基編輯是基因編輯技術的一種，它是指通過基因工程手段對特定dna位點進行核苷酸替換的過程。堿基編輯系為含有cas蛋白與脫氨酶的融合蛋白，在特定cas蛋白識別并打開dna雙鏈的情況下，脫氨酶催化核苷酸堿基的脫氨反應，從而實現堿基的轉換。但是，目前主流的堿基編輯系統僅包括胞嘧啶堿基編輯系統(cytosine?base?editor，cbe)和腺嘌呤堿基編輯系統(adenine?base?editor，abe)，它們分別含有胞嘧啶核苷酸脫氨酶和腺嘌呤核苷酸脫氨酶，僅能實現c-to-t和a-to-g的堿基轉換，無法實現其他類型的堿基替換，應用領域和場景受到限制。
4、為了實現更多類型的精準堿基替換，2019年開發了一種引導編輯器(primeeditor，pe)，pe通過逆轉錄酶對模版rna的逆轉錄作用，將目標突變引入靶點dna，可以實現所有12種類型的堿基的替換，以及以位點特異性方式插入或缺失任何短的核苷酸段。值得注意的是，pe編輯可以實現較低的意外indel率。因此，pe可以實現較為精準的靶向插入，使以前不可能或不切實際的編輯應用成為可能。
5、然而，迄今為止多數基因編輯工具都是在已經發現的兩類cas系統的基礎上進行的設計、改進和應用，而對編輯工具的結構性優化和模塊化改良的研究較少，應用場景和領域受限。
技術實現思路
1、專利技術要解決的問題
2、為了豐富基因編輯的應用場景，同時為本領域提供多種基因編輯工具的選擇，本申請專利技術人經過大量的實驗和探索，通過模塊化組裝，人工合成了具有核苷酸替換、插入或刪除功能的模塊化基因編輯工具。
3、用于解決問題的方案
4、本專利技術的第一方面提供了一種模塊化蛋白，所述模塊化蛋白包括如下功能域：
5、(a)包含如seq?id?no:2所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:2所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的功能域；
6、(b)包含如seq?id?no:3所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:3所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的功能域；
7、(c)包含如seq?id?no:4所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:4所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的功能域；
8、(d)包含如seq?id?no:5所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:5所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的功能域；
9、(e)包含如seq?id?no:6所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:6所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的功能域；和
10、(f)包含如seq?id?no:7所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:7所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的功能域；
11、所述模塊化蛋白還包括：
12、(g)dna聚合酶結構域，所述dna聚合酶結構域位于所述模塊化蛋白非末端的中間區域，以末端融合或嵌入的方式與上述(a)～(f)中的至少一種功能域連接。
13、在一些實施方案中，所述dna聚合酶為rna依賴性dna聚合酶或dna依賴性dna聚合酶，優選為逆轉錄酶。
14、在一些具體的實施方案中，所述dna聚合酶結構域序列包含如seq?id?no:1所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:1所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述dna聚合酶結構域包含(a)包含選自f156y、f156v、f157y、d525n、d201c中任一種的突變，所述氨基酸位置參考seq?id?no:1；(b)connection序列被缺失；和/或(c)rnase?h結構域被突變或缺失(參見，專利wo2023030534a1)。
15、在一些實施方案中，所述模塊化蛋白還包括：
16、(h)包含如seq?id?no:8所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:8所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列的功能域。...
【技術保護點】
1.一種模塊化蛋白，所述模塊化蛋白包括如下功能域：
2.根據權利要求1所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述DNA聚合酶為RNA依賴性DNA聚合酶或DNA依賴性DNA聚合酶，優選為逆轉錄酶。
3.根據權利要求2所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述DNA聚合酶結構域序列包含如SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列、或與SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列、或其功能變體。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述模塊化蛋白還包括：
5.根據權利要求1-4中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述模塊化蛋白包含以下序列中的一種或多種：
6.根據權利要求1-5中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述DNA聚合酶結構域嵌入功能域(f)；優選的，所述DNA聚合酶結構域嵌入功能域(f)中相對于SEQ?ID?NO:7的第143-146位氨基酸間的任意位置。
7.根據權利要求6所述模塊化蛋白
8.根據權利要求1-5中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述DNA聚合酶結構域以末端融合的方式連接在功能域(b)的C端和功能域(c)的N端。
9.根據權利要求8所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述模塊化蛋白包含以下序列中的一種或多種：
10.根據權利要求1-9中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述末端融合或嵌入的方式包括直接融合和/或通過接頭連接。
11.根據權利要求10所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述接頭包含氨基酸序列(GGGS)n(SEQ?ID?NO:43)、(GGGGS)n(SEQ?ID?NO:41)、(G)n、(EAAAK)n(SEQ?ID?NO:42)、(GGS)n、(SGGS)n(SEQ?ID?NO:44)、SGSETPGTSESATPES(SEQ?ID?NO:45)、SGGSSGGSSGSETPGTSESATPESSGGSSGGS(SEQ?ID?NO:46)或(XP)n基序或其組合，其中n獨立地為1-32的整數，并且其中X是任何氨基酸。
12.一種堿基編輯系統，其特征在于，所述堿基編輯系統包括：
13.根據權利要求12所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述mgRNA從5’至3’方向包含引導序列、支架序列、逆轉錄模板(RT)序列和引物結合位點(PBS)序列。
14.根據權利要求13所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述RT序列為外源供體DNA或RNA，用于插入外源核苷酸序列。
15.根據權利要求13所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述PBS序列被設置為與核酸分子靶序列的至少一部分互補；
16.根據權利要求12-15任一項所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述模塊化蛋白在mgRNA的引導下結合核酸分子靶序列，通過DNA修復將所述RT序列代替或插入于相應的內源核苷酸序列。
17.權利要求12-16任一項所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述堿基編輯系統還包括：(iii)核定位序列(NLS)。
18.一種產生至少一個經遺傳修飾的細胞的方法，其特征在于，所述方法包括將如權利要求1-11任一項所述的模塊化蛋白或如權利要求12-17任一項所述的堿基編輯系統導入至少一個細胞，由此導致所述至少一個細胞中靶核酸區域內的核酸序列發生取代、插入或刪除。
19.根據權利要求18所述的方法，其特征在于，所述模塊化蛋白或堿基編輯系統通過選自以下的方法導入細胞：磷酸鈣轉染、原生質融合、電穿孔、脂質體轉染、微注射、病毒感染(如桿狀病毒、痘苗病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或其他病毒)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)介導、基因槍法、PEG介導的原生質體轉化和/或土壤農桿菌介導的轉化。
20.根據權利要求18或19所述的方法，其特征在于，所述細胞來自原核生物如細菌、真核生物如植物、真菌或脊柱動物。
21.根據權利要求20所述的方法，其特征在于，所述脊柱動物是哺乳動物如人、小鼠、大鼠、猴、犬、豬、羊、牛、貓；所述植物是作物植物，例如小麥、水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、苜蓿、棉花、大麥、粟、甘蔗、番茄、煙草、木薯或馬鈴薯。
22.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸編碼如權利要求1-11任一項所述的模塊化蛋白或如權利要求12-17任一項所述的堿基編輯系統。
23.一種表達構建體，其特征在于，所述表達構建體包含如權利要...
【技術特征摘要】
1.一種模塊化蛋白，所述模塊化蛋白包括如下功能域：
2.根據權利要求1所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述dna聚合酶為rna依賴性dna聚合酶或dna依賴性dna聚合酶，優選為逆轉錄酶。
3.根據權利要求2所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述dna聚合酶結構域序列包含如seq?id?no:1所示的氨基酸序列、或與seq?id?no:1所示的氨基酸序列具有至少80％、82％、85％、87％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列、或其功能變體。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述模塊化蛋白還包括：
5.根據權利要求1-4中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述模塊化蛋白包含以下序列中的一種或多種：
6.根據權利要求1-5中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述dna聚合酶結構域嵌入功能域(f)；優選的，所述dna聚合酶結構域嵌入功能域(f)中相對于seq?id?no:7的第143-146位氨基酸間的任意位置。
7.根據權利要求6所述模塊化蛋白，其特征在于，所述模塊化蛋白包含以下序列中的一種或多種：
8.根據權利要求1-5中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述dna聚合酶結構域以末端融合的方式連接在功能域(b)的c端和功能域(c)的n端。
9.根據權利要求8所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述模塊化蛋白包含以下序列中的一種或多種：
10.根據權利要求1-9中任一項所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述末端融合或嵌入的方式包括直接融合和/或通過接頭連接。
11.根據權利要求10所述的模塊化蛋白，其特征在于，所述接頭包含氨基酸序列(gggs)n(seq?id?no:43)、(ggggs)n(seq?id?no:41)、(g)n、(eaaak)n(seq?id?no:42)、(ggs)n、(sggs)n(seq?id?no:44)、sgsetpgtsesatpes(seq?id?no:45)、sggssggssgsetpgtsesatpessggssggs(seq?id?no:46)或(xp)n基序或其組合，其中n獨立地為1-32的整數，并且其中x是任何氨基酸。
12.一種堿基編輯系統，其特征在于，所述堿基編輯系統包括：
13.根據權利要求12所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述mgrna從5’至3’方向包含引導序列、支架序列、逆轉錄模板(rt)序列和引物結合位點(pbs)序列。
14.根據權利要求13所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述rt序列為外源供體dna或rna，用于插入外源核苷酸序列。
15.根據權利要求13所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述pbs序列被設置為與核酸分子靶序列的至少一部分互補；
16.根據權利要求12-15任一項所述的堿基編輯系統，其特征在于，所述模塊化蛋白在mgrna的引導下結合核酸分子靶...
【專利技術屬性】
技術研發人員：請求不公布姓名，請求不公布姓名，請求不公布姓名，
申請(專利權)人：北京齊禾生科生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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