【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于重組病毒，尤其涉及一種表達h1n1亞型豬流感病毒ha蛋白的重組蓋塔病毒的構建方法及其應用。
技術介紹
1、蓋塔病毒(getah?virus,getv)是一種單股正鏈rna病毒，所屬披膜病毒科，甲病毒屬。在1955年被發現于馬來西亞雪背庫蚊中。getv可以在蚊子體內繁殖，并且通過叮咬傳播給其他宿主動物。在21世紀初以來，getv感染的地理范圍和宿主進一步擴大。我國豬場getv的陽性率還在呈上升趨勢。為了控制上升趨勢，研發相關的getv疫苗變得迫在眉睫。getv具有典型的甲病毒特征，具有可以穩定大量表達外源基因，能夠引起免疫動物產生相對應的特異性抗體，這些均提示了getv可選用作為載體表達其他外源基因構建二聯疫苗的可能性。
2、豬流感病毒(swine?influenza?virus,siv)是一種單股負鏈rna病毒，整個基因組由pb2、pb1、pa、ha、np、na、m1、m2八個結構蛋白和ns1、ns2兩個非結構蛋白組成，流感病毒的亞型由ha和na來區別，ha作為siv最重要的免疫原性蛋白，選用ha1蛋白作為外源基因的截取部位插入可以能有效引起機體產生免疫應答。h1n1亞型豬流感病毒一直流行于世界各國養豬業，甚至出現豬流感病毒從豬傳人的現象，所以對于流感病毒研制相關疫苗進行豬場的防控是必不可少的。
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是提供一種表達h1n1亞型豬流感病毒ha蛋白的重組蓋塔病毒的構建方法及其應用，所得的滅活疫苗既具有很好的安全性，又可以
2、為解決上述技術問題，本專利技術采用以下技術方案：
3、表達h1n1亞型豬流感病毒ha蛋白的重組蓋塔病毒，該病毒具有h1n1亞型豬流感病毒ha1蛋白基因，且ha1蛋白基因位于蓋塔病毒基因組的e1和3’utr基因之間。
4、上述重組蓋塔病毒的構建方法，在構建好的感染性克隆pgetv-gx載體上，在getv的e1和3’utr之間插入h1n1亞型豬流感病毒ha1蛋白，從而獲得重組病毒rgeeh1n1-ha1；感染性克隆pgetv-gx載體由保藏編號為cctcc?no：v?202069的蓋塔病毒制備而來；h1n1亞型豬流感病毒為h1n1亞型豬流感病毒cz7毒株(a/swine/guangxi/cz7/2014(h1n1)。
5、上述構建方法中，利用soe-pcr方法將在getv感染性克隆將部分getv基因組序列與分泌肽usp、截短的h1n1?ha1的蛋白基因，以及flag標簽進行融合，再利用bstbi和mlui兩個限制性酶切位點，將融合片段插入e1和3’utr基因之間，得到重組質粒pgeeh1n1-ha1，再經轉染敏感細胞系進行病毒拯救，獲得重組表達h1n1亞型豬流感病毒ha蛋白的重組蓋塔病毒rgeeh1n1-ha1。
6、重組質粒按以下操作進行構建：首先，使用擴增引物bstbi-f1/e1-t2a-r1和flag-3’utr-f3/mlu?i-r3，以getv全長感染性克隆pgetv-gx為模板，擴增出包含有限制性酶切位點bstbi的pcr產物1和含有限制性酶切位點mlu?ipcr產物2；然后，使用突變引物t2a-h1n1-ha1-f2和h1n1-ha1-flag-r2，以豬流感病毒質粒ph1n1-ha為模板，擴增出包含有h1n1-ha1蛋白的序列和flag標簽序列的pcr產物3；接著，以pcr產物3和pcr產物2為模板，使用引物t2a-h1n1-ha1-f2和mlui-r3進行融合pcr擴增，以融合后的pcr產物4和pcr產物1為模板，使用外側引物bstbi-f1和mlui-r3進行最后一次融合擴增，得到pcr產物5；最后，使用bstbi和mlui酶切載體pgetv-gx和pcr產物片段5，通過一步克隆法將pcr產物片段5至pgetv-gx中，即得重組質粒pgeeh1n1-ha1。
7、擴增引物bstbi-f1、e1-t2ar1、flag-3’utr-f3、mlui-r3、t2a-h1n1-ha1-f2、h1n1-ha1-flag-r2分別具有序列表seq.no.id.1-6的堿基序列；敏感細胞為bhk-21細胞、pk-15細胞、marc-145細胞。
8、上述重組蓋塔病毒或重組質粒在制備藥物或疫苗方面的應用。
9、疫苗為滅活疫苗。
10、重組蓋塔病毒滅活疫苗的制備方法，將上述重組病毒或構建方法構建得到的重組病毒擴繁后進行滅活，然后加入疫苗佐劑即得。
11、滅活后進行中和。
12、擴繁至病毒毒價至少達到106tcid50/ml；滅活采用終濃度為0.15％的甲醛作為滅活劑37℃滅活24小時；中和采用5％的na2s203溶液中和30分鐘；疫苗佐劑為商品化鋁鹽佐劑，用量按1:1加入。
13、針對目前h1n1亞型豬流感病毒防控需要，專利技術結合在先研究的成果構建了一種表達h1n1亞型豬流感病毒ha蛋白的重組蓋塔病毒，該病毒具有h1n1亞型豬流感病毒ha1蛋白基因，且ha1蛋白基因位于蓋塔病毒基因組的e1和3’utr基因之間。據此，還建立了相應構建方法，在構建好的感染性克隆pgetv-gx載體上，在getv的e1和3’utr之間插入h1n1亞型豬流感病毒ha1蛋白，從而獲得重組病毒rgeeh1n1-ha1；感染性克隆pgetv-gx載體由保藏編號為cctcc?no：v?202069的蓋塔病毒制備而來；h1n1亞型豬流感病毒為h1n1亞型豬流感病毒cz7毒株(a/swine/guangxi/cz7/2014(h1n1)。進一步地，還研制了相應重組蓋塔病毒滅活疫苗。試驗研究表明，本專利技術的rgeeh1n1-ha1滅活疫苗免疫小鼠，可以很好的誘導試驗動物產生針對h1n1亞型豬流感病毒的特異性抗體，同時也可產生表達蓋塔病毒的的特異性抗體，并且對h1n1亞型豬流感病毒的攻擊提供免疫保護，成功制備了h1n1亞型豬流感病毒和蓋塔病毒二聯滅活疫苗。由此可見，本專利技術對h1n1亞型豬流感病毒的防控具有較好的效果，同時也為蓋塔病毒作為載體表達其他外源基因奠定了基礎，有望在臨床中使用，同時可以保護豬場免于蓋塔病毒和h1n1亞型豬流感病毒的攻擊。
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1.表達H1N1亞型豬流感病毒HA蛋白的重組蓋塔病毒，其特征在于該病毒具有H1N1亞型豬流感病毒HA1蛋白基因，且HA1蛋白基因位于蓋塔病毒基因組的E1和3’UTR基因之間。
2.權利要求1所述重組蓋塔病毒的構建方法，其特征在于：在構建好的感染性克隆pGETV-GX載體上，在GETV的E1和3’UTR之間插入H1N1亞型豬流感病毒HA1蛋白，從而獲得重組病毒rGEEH1N1-HA1；所述感染性克隆pGETV-GX載體由保藏編號為CCTCC?NO：V?202069的蓋塔病毒制備而來；所述H1N1亞型豬流感病毒為H1N1亞型豬流感病毒CZ7毒株。
3.根據權利要求2所述重組蓋塔病毒的構建方法，其特征在于：利用SOE-PCR方法將在GETV感染性克隆將部分GETV基因組序列與分泌肽USP、截短的H1N1?HA1的蛋白基因，以及Flag標簽進行融合，再利用BstbI和MluI兩個限制性酶切位點，將融合片段插入E1和3’UTR基因之間，得到重組質粒pGEEH1N1-HA1，再經轉染敏感細胞系進行病毒拯救，獲得重組表達H1N1亞型豬流感病毒HA蛋白的重組蓋塔病毒rGE
4.據權利要求3所述重組蓋塔病毒的構建方法，其特征在于所述重組質粒按以下操作進行構建：首先，使用擴增引物BstbI-F1/E1-T2A-R1和Flag-3’UTR-F3/Mlu?I-R3，以GETV全長感染性克隆pGETV-GX為模板，擴增出包含有限制性酶切位點BstbI的PCR產物1和含有限制性酶切位點Mlu?IPCR產物2；然后，使用突變引物T2A-H1N1-HA1-F2和H1N1-HA1-Flag-R2，以豬流感病毒質粒pH1N1-HA為模板，擴增出包含有H1N1-HA1蛋白的序列和Flag標簽序列的PCR產物3；接著，以PCR產物3和PCR產物2為模板，使用引物T2A-H1N1-HA1-F2和MluI-R3進行融合PCR擴增，以融合后的PCR產物4和PCR產物1為模板，使用外側引物BstbI-F1和MluI-R3進行最后一次融合擴增，得到PCR產物5；最后，使用BstbI和MluI酶切載體pGETV-GX和PCR產物片段5，通過一步克隆法將PCR產物片段5至pGETV-GX中，即得重組質粒pGEEH1N1-HA1。
5.據權利要求3所述重組蓋塔病毒的構建方法，其特征在于：所述擴增引物BstbI-F1、E1-T2A?R1、Flag-3’UTR-F3、MluI-R3、T2A-H1N1-HA1-F2、H1N1-HA1-Flag-R2分別具有序列表SEQ.NO.ID.1-6的堿基序列；所述敏感細胞為BHK-21細胞、PK-15細胞、MARC-145細胞。
6.權利要求1所述重組蓋塔病毒或權利要求3所述重組質粒在制備藥物或疫苗方面的應用。
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于：所述疫苗為滅活疫苗。
8.一種重組蓋塔病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于將權利要求1所述重組病毒或權利要求2所述構建方法構建得到的重組病毒擴繁后進行滅活，然后加入疫苗佐劑即得。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于：所述滅活后進行中和。
10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于：所述擴繁至病毒毒價至少達到106TCID50/mL；所述滅活采用終濃度為0.15％的甲醛作為滅活劑37℃滅活24小時；所述中和采用5％的Na2S203溶液中和30分鐘；所述疫苗佐劑為商品化鋁鹽佐劑，用量按1:1加入。
...【技術特征摘要】
1.表達h1n1亞型豬流感病毒ha蛋白的重組蓋塔病毒，其特征在于該病毒具有h1n1亞型豬流感病毒ha1蛋白基因，且ha1蛋白基因位于蓋塔病毒基因組的e1和3’utr基因之間。
2.權利要求1所述重組蓋塔病毒的構建方法，其特征在于：在構建好的感染性克隆pgetv-gx載體上，在getv的e1和3’utr之間插入h1n1亞型豬流感病毒ha1蛋白，從而獲得重組病毒rgeeh1n1-ha1；所述感染性克隆pgetv-gx載體由保藏編號為cctcc?no：v?202069的蓋塔病毒制備而來；所述h1n1亞型豬流感病毒為h1n1亞型豬流感病毒cz7毒株。
3.根據權利要求2所述重組蓋塔病毒的構建方法，其特征在于：利用soe-pcr方法將在getv感染性克隆將部分getv基因組序列與分泌肽usp、截短的h1n1?ha1的蛋白基因，以及flag標簽進行融合，再利用bstbi和mlui兩個限制性酶切位點，將融合片段插入e1和3’utr基因之間，得到重組質粒pgeeh1n1-ha1，再經轉染敏感細胞系進行病毒拯救，獲得重組表達h1n1亞型豬流感病毒ha蛋白的重組蓋塔病毒rgeeh1n1-ha1。
4.據權利要求3所述重組蓋塔病毒的構建方法，其特征在于所述重組質粒按以下操作進行構建：首先，使用擴增引物bstbi-f1/e1-t2a-r1和flag-3’utr-f3/mlu?i-r3，以getv全長感染性克隆pgetv-gx為模板，擴增出包含有限制性酶切位點bstbi的pcr產物1和含有限制性酶切位點mlu?ipcr產物2；然后，使用突變引物t2a-h1n1-ha1-f2和h1n1-ha1-flag-r2，以豬流感病毒質粒ph1n1-ha為模板，擴增出包含有h1n1-h...
【專利技術屬性】
技術研發人員：韋祖樟，張麗萍，隋夢琪，陳櫻，任同偉，王豪，黃偉堅，歐陽康，覃一峰，
申請(專利權)人：廣西大學，
類型：發明
國別省市：
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