【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
專利
本專利技術(shù)涉及用于醫(yī)學中的新的免疫調(diào)節(jié)的復(fù)制高效的痘苗病毒株(iova)及其衍生物。
技術(shù)介紹
0、專利技術(shù)背景
1、最近，病毒在人類癌癥的治療中作為溶瘤病毒首次獲得市場認可。這樣的成功將科學興趣重新集中于一般的病毒，并且也集中于痘苗病毒用于癌癥治療的用途。痘苗病毒的使用已證明不僅在疫苗接種方法(例如防止人類痘病毒感染)中是有效的，而且還已應(yīng)用到許多其他醫(yī)學治療和臨床試驗中，例如腫瘤疫苗接種中。
2、科學界從在溶瘤病毒的第一批臨床研究中獲得的數(shù)據(jù)得知，這些病毒或設(shè)計的病毒載體能夠在癌細胞中選擇性復(fù)制，并且積極促進此類感染的癌細胞的裂解。然而，此類感染的癌細胞的直接裂解很少足以根除大塊的腫瘤，并且很少治愈轉(zhuǎn)移性疾病。這些結(jié)果表明，不僅對更強效和選擇性的病毒，而且對避免疾病復(fù)發(fā)的替代腫瘤破壞機制的需求日益增長。
3、最近，基于痘苗病毒的病毒和病毒載體被作為溶瘤劑進行了測試，并且由于其通過與直接裂解腫瘤細胞不同的機制破壞腫瘤的能力而被認為是最有前景的(kim等人，2009)。一方面，已證明病毒在腫瘤相關(guān)內(nèi)皮細胞中的復(fù)制導致腫瘤血流的破壞、缺氧和大量腫瘤壞死(breitbach等人，2013)；另一方面，由于裂解后釋放了腫瘤相關(guān)抗原(taa)并且克服了腫瘤內(nèi)存在的局部免疫抑制作用，因此痘苗病毒在腫瘤內(nèi)的復(fù)制能夠誘導抗腫瘤免疫應(yīng)答(thorne等人，2010)。
4、這些替代機制被證明是臨床評估中的關(guān)鍵，并且突顯了免疫系統(tǒng)在確定溶瘤載體的活性方面的關(guān)鍵作用。在隨機臨床試驗中，最有
5、因此，本專利技術(shù)的目的是提供用于治療人類疾病的新適應(yīng)的和/或更強效的病毒和/或病毒載體，其中所述病毒或載體在感染后在需要這種治療的患者體內(nèi)引發(fā)和/或活化另外的且更強大的但(出于安全性原因)高度特異性的免疫應(yīng)答。
6、此目標已經(jīng)通過如本申請的權(quán)利要求1中所述的最新鑒定的免疫調(diào)節(jié)的復(fù)制高效的痘苗病毒株得到解決。另外的實施方案涉及這種最新鑒定和/或適應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒以及載體的變型，在所附權(quán)利要求中描述了包含最新鑒定和/或適應(yīng)的痘苗病毒株的優(yōu)選用途和組合物。
7、在研究對已知痘苗病毒株的免疫應(yīng)答時，并且特別是與特征明確的痘苗病毒株(western?reserve(wr))進行比較時，專利技術(shù)人能夠分離、產(chǎn)生并表征新的痘苗病毒株。這種新型株顯示出明顯改善的免疫學特征。不受理論的束縛，我們認為所述新型株在感染腫瘤細胞后還顯示出對增加的免疫原性細胞死亡的強烈促進，并因此將免疫反應(yīng)重定向至感染的和尚未感染的腫瘤細胞。
8、痘苗病毒wr株是明確定義的病毒株，所述病毒株由于其在腫瘤細胞中的高復(fù)制能力已被測試為溶瘤的，并且被用于遞送gm-csf以增加針對腫瘤的免疫應(yīng)答。為了提供具有腫瘤選擇性的載體，成功缺失了涉及活化感染細胞的代謝的不同痘苗病毒基因，從而限制了所得病毒載體向具有高復(fù)制指數(shù)的細胞的復(fù)制。在臨床試驗中測試的候選病毒中已經(jīng)包括了諸如胸苷激酶或病毒生長因子等基因的缺失(zeh等人，2015)。
9、wo2015027163是一個實例，其中描述了溶瘤痘苗病毒，所述溶瘤痘苗病毒在一些典型的病毒免疫逃逸基因中包含基因組缺失。在這種特定情況下，溶瘤病毒在例如b8r、b18r和a35r基因中包含缺失。
10、ep2136633是另一個實例，其描述了溶瘤治療方法中表達gm-csf的痘苗病毒的治療用途。
11、在這些腫瘤學方法中，痘苗病毒wr株被認為是目前用于開發(fā)和比較最新開發(fā)的溶瘤痘苗病毒的黃金標準。
12、但是，除了這種所謂的成功之外，仍然存在一些擔憂，考慮將痘苗病毒wr作為重癥癌癥患者治療方法的基礎(chǔ)。由于痘苗病毒wr是在小鼠腦中多次傳代后在體內(nèi)選擇的，這實際上導致了病毒在小鼠細胞中具有高復(fù)制能力，由于親神經(jīng)性和神經(jīng)毒性還導致了驚人的毒力，這可能會阻礙其在癌癥患者治療中的安全使用。
13、然而，在本申請的上下文中，選擇痘苗病毒wr作為與本專利技術(shù)的最新開發(fā)的痘苗病毒株的比較，其中本專利技術(shù)的主要目的是提供一種新型的免疫調(diào)節(jié)的具有復(fù)制能力的痘苗病毒株，其具有顯著改善的免疫學特征以及高裂解和/或溶瘤能力。
14、與痘苗病毒的高度減毒的mva(修飾的痘苗安卡拉(modifiedvaccinia?ankara))株的另外的比較似乎是無用的，因為mva的特征在于其宿主范圍限制，或者換言之，其在哺乳動物宿主細胞中的復(fù)制缺陷。mva已經(jīng)廣泛用于遞送抗原以針對病原體進行疫苗接種(綜述參見volz和sutter，2017)，并且已經(jīng)就其生物學和免疫學特征進行了表征(meyer等人，1991)。此外，mva是一種高度修飾的無法在哺乳動物細胞中復(fù)制的痘苗病毒，并且先前已經(jīng)用于通過遞送腫瘤相關(guān)抗原(taa)進行的針對腫瘤的疫苗接種(zhang等人，2012)。盡管事實是這種病毒似乎顯示出理想的安全性并且被證明可以有效地針對體內(nèi)表達的腫瘤抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但是大多數(shù)患者并未顯示出任何可驗證的抗腫瘤應(yīng)答；似乎所引發(fā)的免疫受到腫瘤內(nèi)部局部發(fā)生的免疫抑制作用的阻礙，從而導致無效的抗腫瘤應(yīng)答(marigo等人，2008)。
15、因此，盡管可以說已經(jīng)朝著改善的免疫療法取得了進展，但是仍然需要將更有效的痘苗病毒株用于癌癥的病毒療法以建立能夠根除癌癥的有效免疫應(yīng)答。
16、現(xiàn)在，本專利技術(shù)描述了朝向此目標邁進的又一步，并且公開了一種新型的痘苗病毒株，其在人類和小鼠細胞中具有復(fù)制能力，并且根據(jù)專利技術(shù)人的最佳知識，即使是一般的第一痘苗病毒也是如此，所述第一痘苗病毒通常會導致免疫相關(guān)的鈣網(wǎng)蛋白(crt)向外膜易位并且因此引起鈣網(wǎng)蛋白在感染細胞的外細胞膜上暴露，因此引發(fā)強效和改善的免疫應(yīng)答。
17、鈣網(wǎng)蛋白(crt)似乎是一種多功能蛋白并且已被描述為涉及激素應(yīng)答dna元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及mhc?i類蛋白的成熟；它還被描述為結(jié)合并滅活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的ca2+離子或錯誤折疊蛋白質(zhì)，并且主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(er)的儲藏室中。crt代表er內(nèi)腔中含量最豐富的蛋白質(zhì)，但是在細胞死亡的情況下，一部分蛋白質(zhì)可以從er內(nèi)腔轉(zhuǎn)移到細胞表面；更具體地，已經(jīng)表明crt在細胞表面上充當“吃我(eat-me)”信號(gardai等人，2005)，從而介導cd91陽性細胞(主要是巨噬細胞和樹突狀細胞(dc))的吞噬。
18、新型痘苗病毒株被描述為在哺乳動物細胞中具有復(fù)制能力。不受此理論限制，據(jù)信，這種特性尤其取決于病毒骨架中k1l基因的存在和功能活性。具體地，已經(jīng)顯示所述新型株在哺乳動物(本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒在哺乳動物細胞中具有復(fù)制能力，并且引起鈣網(wǎng)蛋白易位至感染細胞的膜，因此促進免疫原性細胞死亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒為A56R陰性，或者其中所述病毒為A26R和A56R陰性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒和/或其任何衍生物通過在突變的如SEQ?ID?No.：1所定義的作為病毒基因組的一部分的C2-C?1-N1-N2區(qū)的核苷酸序列上存在一個BstXI限制酶位點來定義。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒為K1L陽性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒另外包含選自由以下組成的開放閱讀框的組的一個或多個功能性失活的免疫逃逸基因：B21R、C?10L、C9L、C4L、C2L、N1L、N2L、M1L、A51R、A52R、A55R和B13R/B14R。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒另外包含選自由J2R、C11R和F4L組成的組的至少
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒具有復(fù)制能力并且在細胞周期活化細胞和/或腫瘤細胞中裂解。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒在感染后引起合胞體的形成。
9.一種核酸序列或其片段，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至8所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒。
10.一種免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒的病毒載體或衍生物，其包含根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸序列或其主要部分。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒在哺乳動物細胞中具有復(fù)制能力，并且引起鈣網(wǎng)蛋白易位至感染細胞的膜，因此促進免疫原性細胞死亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒為a56r陰性，或者其中所述病毒為a26r和a56r陰性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒和/或其任何衍生物通過在突變的如seq?id?no.：1所定義的作為病毒基因組的一部分的c2-c?1-n1-n2區(qū)的核苷酸序列上存在一個bstxi限制酶位點來定義。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒為k1l陽性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的免疫調(diào)節(jié)痘苗病毒，其中所述病毒另外包含選自由以下組成的開放閱讀框的組的一個或多個功能性失活的免疫逃逸基...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蓋德·蘇特，胡安·約瑟·羅哈斯·埃普斯圖，
申請(專利權(quán))人：瑪麗恩·克里斯汀蘇特，
類型：發(fā)明
國別省市：
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