【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及病毒檢測(cè)。更具體地說(shuō)，本專(zhuān)利技術(shù)涉及一種基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)引物探針組、試劑盒及檢測(cè)方法與應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、人星狀病毒（human?astrovirus，hastv）是一種無(wú)包膜的rna病毒，基因組為一條長(zhǎng)約6.1~7.9?kb的單股正鏈rna，病毒粒子在電鏡下呈星狀，直徑約28~30?nm，屬于星狀病毒科（ astroviridae）哺乳動(dòng)物星狀病毒屬（ mamastrovirus）。hastv是引起嬰幼兒、老年人及免疫缺陷病人急性胃腸炎的重要病原之一，主要通過(guò)糞口途徑或人人直接接觸傳播。hastv共有三個(gè)遺傳進(jìn)化分支，形成三個(gè)病毒群，分別為經(jīng)典群、mlb群和va群。hastv經(jīng)典群是最早被發(fā)現(xiàn)的hastv病毒群，于1975年在appleton和higgins用電鏡檢測(cè)胃腸炎患兒糞便標(biāo)本時(shí)首次被發(fā)現(xiàn)。hastv經(jīng)典群含有8個(gè)血清型hastv（hastv-1到8），主要感染幼童，導(dǎo)致輕度到重度的胃腸炎。直到2008年，科學(xué)家首次發(fā)現(xiàn)了兩種新發(fā)的hastv病毒群，分別為mlb群和va群。有研究發(fā)現(xiàn)：新發(fā)的mlb群和va群可導(dǎo)致更嚴(yán)重的胃腸炎和神經(jīng)損害，相比經(jīng)典群，mlb群和va群在遺傳上與動(dòng)物星狀病毒距離更近，提示可能存在一個(gè)人和動(dòng)物之間的跨宿主傳播，具有潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。
2、多重?zé)晒舛縫cr技術(shù)是在熒光定量pcr基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新技術(shù)，強(qiáng)調(diào)在同一個(gè)反應(yīng)體系里同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶標(biāo)。但是到目前
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)提供一種基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)引物探針組、試劑盒及檢測(cè)方法與應(yīng)用，針對(duì)hastv經(jīng)典型、mlb型、va型基因組，進(jìn)行長(zhǎng)序列分析，設(shè)計(jì)引物和探針，對(duì)設(shè)計(jì)的多對(duì)引物探針組合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)篩選優(yōu)化，獲得最佳引物探針組合，建立了三重實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法，為診斷和防控提供技術(shù)支持。
2、為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本專(zhuān)利技術(shù)的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)引物探針組，包括：
3、人星狀病毒經(jīng)典型：
4、上游引物hastv-classic-f：5’-tcactccatgggaagctccta-3’；
5、下游引物hastv-classic-r：5’-gatggagttgctcttctgtga-3’；
6、探針hastv-classic-p：5’-aggccagagtcacgaagctgcttwgc-3’；
7、人星狀病毒mlb型：
8、上游引物hastv-mlb-f：5’-tagctcttcatgggaaact-3’；
9、下游引物hastv-mlb-r：5’-cttcgagtgaagcgccttgg-3’；
10、探針hastv-mlb-p：5’-ttgtgcttccagttgttgatggc-3’；
11、人星狀病毒va型：
12、上游引物hastv-va-f：5’-gtggtggggaagaaccctat-3’；
13、下游引物hastv-va-r：5’-tcctgtttgaccacytcctt-3’；
14、探針hastv-va-p：5’-acggatagcatgctggataggctt-3’；
15、各探針序列兩端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，各探針序列標(biāo)記的熒光基團(tuán)不同。
16、優(yōu)選的是，
17、人星狀病毒經(jīng)典型探針在5’端標(biāo)記fam熒光基團(tuán)，在3’端標(biāo)記bhq1淬滅基團(tuán)；
18、人星狀病毒mlb型探針在5’端標(biāo)記rox熒光基團(tuán)，在3’端標(biāo)記bhq2淬滅基團(tuán)；
19、人星狀病毒va型探針在5’端標(biāo)記cy5熒光基團(tuán)，在3’端標(biāo)記bhq2淬滅基團(tuán)。
20、所述的引物探針組在制備檢測(cè)人星狀病毒經(jīng)典型、mlb型、va型的一種或兩種或三種試劑盒中的應(yīng)用。
21、優(yōu)選的是，待檢測(cè)樣品選自人糞便或者肛拭子樣本。
22、基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，包括所述的引物探針組，熒光定量pcr反應(yīng)液，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照品。
23、優(yōu)選的是，熒光定量pcr反應(yīng)液包括，以20μl計(jì)：
24、含ung酶的探針?lè)╭pcr預(yù)混液10?μl，濃度均為10?μm的引物hastv-classic-f、hastv-classic-r、hastv-mlb-f、hastv-mlb-r、hastv-va-f和hastv-va-r各0.4μl，濃度均為10?μm的探針hastv-classic-p為0.8?μl、hastv-mlb-p和hastv-va-p各0.2μl，模板2μl，超純水補(bǔ)足20?μl。
25、優(yōu)選的是，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品包括hastv-classic標(biāo)準(zhǔn)品、hastv-mlb標(biāo)準(zhǔn)品和hastv-va標(biāo)準(zhǔn)品：
26、hastv-classic標(biāo)準(zhǔn)品為重組克隆質(zhì)粒puc-57-classic，含有所述熒光定量pcr反應(yīng)液中hastv-classic引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)核酸序列；
27、hastv-mlb標(biāo)準(zhǔn)品為重組克隆質(zhì)粒puc-57-mlb，含有所述熒光定量pcr反應(yīng)液中hastv-mlb引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)核酸序列；
28、hastv-va標(biāo)準(zhǔn)品為重組克隆質(zhì)粒puc-57-va，含有所述熒光定量pcr反應(yīng)液中hastv-va引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的目標(biāo)核酸序列。
29、優(yōu)選的是，陰性對(duì)照品為無(wú)rna酶雙蒸水。
30、基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)方法，包括以下步驟：
31、提取待檢測(cè)樣品的rna，將其反轉(zhuǎn)錄為cdna，以cdna作為模板，應(yīng)用所述的引物探針組進(jìn)行多重?zé)晒舛縫cr擴(kuò)增反應(yīng)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)pcr擴(kuò)增曲線(xiàn)判定待檢測(cè)樣品中是否感染人星狀病毒經(jīng)典型、mlb型、va型的一本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)引物探針組，其特征在于，包括：
2.如權(quán)利要求1所述的引物探針組，其特征在于，
3.權(quán)利要求1或2所述的引物探針組在制備檢測(cè)人星狀病毒經(jīng)典型、MLB型、VA型的一種或兩種或三種試劑盒中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，待檢測(cè)樣品選自人糞便或者肛拭子樣本。
5.基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的引物探針組，熒光定量PCR反應(yīng)液，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照品。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，熒光定量PCR反應(yīng)液包括，以20μL計(jì)：
7.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品包括HAstV-classic標(biāo)準(zhǔn)品、HAstV-MLB標(biāo)準(zhǔn)品和HAstV-VA標(biāo)準(zhǔn)品：
8.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，陰性對(duì)照品為無(wú)RNA酶雙蒸水。
9.基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
10.如
...【技術(shù)特征摘要】
1.基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)引物探針組，其特征在于，包括：
2.如權(quán)利要求1所述的引物探針組，其特征在于，
3.權(quán)利要求1或2所述的引物探針組在制備檢測(cè)人星狀病毒經(jīng)典型、mlb型、va型的一種或兩種或三種試劑盒中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，待檢測(cè)樣品選自人糞便或者肛拭子樣本。
5.基于長(zhǎng)序列分析的人星狀病毒多重?zé)晒舛縫cr檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的引物探針組，熒光定量pcr反應(yīng)液，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照品。
6.如權(quán)利要求5所述的檢測(cè)試劑盒，...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李朋輝，田豐，王建行，高慧潔，鄭培培，靳增軍，于洪偉，趙婷婷，王珍，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：河北工程大學(xué)，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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