【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種flnb基因敲除的mdck細胞株及其構建方法和應用。
技術介紹
1、mdck細胞（madin-darby?canine?kidney?cells）是從狗腎臟（canine?kidney）組織中分離出的細胞系。mdck細胞生長快速，適應性強，容易培養，并且能在不同的培養基條件下存活。mdck細胞由于在細胞表面存在大量對流感病毒敏感的受體而成為了培養流感病毒的理想細胞系。但天然的mdck細胞黏附性強，結團率高，消化時間長，不利于細胞培養和大規模生產。而馴化懸浮細胞代次較高，細胞成瘤性增加，機制不明確且存在馴化可逆的風險，不利于應用于流感疫苗制造業中。flnb?(?filamin?b?)表達的細絲蛋白b是肌動蛋白結合蛋白，主要定位于胞質，其結構由兩個同源亞基非共價結合形成，flnb通過與其他細胞骨架蛋白的相互作用，參與細胞骨架構建、維持與動態變化，還可以與黏附分子共同介導信號的傳導，這對于細胞的形態、黏附以及遷移都具有重要的意義。因此，本研究采用crispr-cas9基因編輯技術，構建flnb基因敲除的低黏附能力mdck細胞株，對于促進mdck細胞更好的應用于流感疫苗的制造具有重要意義。
技術實現思路
1、鑒于此，本專利技術提供了一種flnb基因敲除的mdck細胞株及其構建方法和應用，采用crispr-cas9基因編輯技術敲除mdck細胞中的flnb基因，獲得黏附能力降低的mdck細胞株。
2、為達到上述目的，本專利技術采用以下技術方案：>
3、第一方面，本專利技術提供了一種flnb基因敲除的方法，利用crispr/cas9技術，針對mdck細胞的flnb基因第1號外顯子設計sgrna，構建flnb基因敲除載體質粒1和質粒2；將質粒1和質粒2轉染進mdck細胞，獲得flnb基因敲除的mdck細胞株。所述flnb基因敲除的細胞株命名為mdck-flnb-ko，已于2024年11月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctcc?no:c2024391。
4、優選地，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no?.1所示。
5、優選地，所述質粒1為px330-sgrna質粒。
6、優選地，所述質粒2為py75-5-3質粒。
7、優選地，所述py75-5-3質粒含有針對所述sgrna的序列識別位點的5'端同源臂和3'端同源臂，所述5'端同源臂的序列如seq?id?no?.2所示，所述3'端同源臂的序列如seqid?no?.3所示。
8、第二方面，本專利技術提供了一種flnb基因敲除的mdck細胞株，根據所述的方法獲得flnb基因敲除的mdck細胞株。
9、最后，本專利技術提供了一種所述的方法獲得flnb基因敲除的mdck細胞株，或所述的flnb基因敲除的mdck細胞株，在制備流感病毒疫苗中的應用。
10、優選地，所述流感病毒包括甲型流感病毒或/和乙型流感病毒。
11、優選地，所述流感病毒包括h1n1、h3n2、bv、by亞型流感病毒中的至少一種。
12、與現有技術相比，本專利技術的有益效果為：
13、（1）本專利技術采用crispr-cas9基因編輯技術敲除mdck細胞中的flnb基因，獲得黏附能力降低的mdck細胞。
14、（2）本專利技術提供的flnb基因敲除的mdck細胞株與mdck原始細胞株相比，細胞增殖能力相似，平臺期細胞總量略大。
15、（3）本專利技術提供的flnb基因敲除的mdck細胞株與mdck原始細胞株相比，生長松散，結團率較低，有利于細胞消化。
16、（4）flnb基因敲除后的mdck細胞，相較于mdck原始細胞株，細胞與基質間黏附能力與胞內ca2+濃度均下降。在95％細胞匯合度下進行胰酶消化，flnb基因敲除后的mdck細胞消化時間明顯減少，大幅度提升了細胞傳代的效率，降低細胞消化工藝時長，有利于應用于流感疫苗大規模生產。
17、（5）flnb基因的表達可能會負調節病毒進入宿主細胞，flnb基因敲除后的mdck細胞能夠提高多種亞型流感病毒的血凝滴度，因此可用于流感病毒疫苗的制備。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種FLNB基因敲除的方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技術，針對MDCK細胞的FLNB基因第1號外顯子設計sgRNA，構建FLNB基因敲除載體質粒1和質粒2；將質粒1和質粒2轉染進MDCK細胞，獲得FLNB基因敲除的MDCK細胞株。所述FLNB基因敲除的細胞株命名為MDCK-FLNB-KO，已于2024年11月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:C2024391。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ?ID?No?.1所示。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述質粒1為pX330-sgRNA質粒。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述質粒2為pY75-5-3質粒。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述pY75-5-3質粒含有針對所述sgRNA的序列識別位點的5'端同源臂和3'端同源臂，所述5'端同源臂的序列如SEQ?ID?No?.2所示，所述3'端同源臂的序列如SEQ?ID?No?.3所示。
6.一種FLNB基
7.根據權利要求1-5任一項所述的方法獲得FLNB基因敲除的MDCK細胞株，或根據權利要求6所述的FLNB基因敲除的MDCK細胞株，在制備流感病毒疫苗中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述流感病毒包括甲型流感病毒或/和乙型流感病毒。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述流感病毒包括H1N1、H3N2、BV、BY亞型流感病毒中的至少一種。
...【技術特征摘要】
1.一種flnb基因敲除的方法，其特征在于，利用crispr/cas9技術，針對mdck細胞的flnb基因第1號外顯子設計sgrna，構建flnb基因敲除載體質粒1和質粒2；將質粒1和質粒2轉染進mdck細胞，獲得flnb基因敲除的mdck細胞株。所述flnb基因敲除的細胞株命名為mdck-flnb-ko，已于2024年11月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccno:c2024391。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列如seq?id?no?.1所示。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述質粒1為px330-sgrna質粒。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述質粒2為py75-5-3質粒。
5.根據權利要求4所述的方法，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張晶，龔錚，陳曉琦，施金榮，樂洋，鄭嘉昊，李思甜，張哲罡，劉博，張家友，
申請(專利權)人：武漢生物制品研究所有限責任公司，
類型：發明
國別省市：
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