【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物分子空間檢測領域。具體地，本專利技術提供了檢測樣品中核酸的空間信息的方法，以及用于所述方法的核酸陣列及產生所述核酸陣列的方法。
技術介紹
1、組織中細胞的空間位置顯著影響其功能，為探究這種空間異質性，需要在獲知空間坐標的情況下，對細胞的基因組或轉錄組進行量化及分析。然而要收集較小的組織區域甚至單個細胞用于基因組或轉錄組分析，非常費力、費錢且精確度低。因此，開發一種能夠實現單細胞甚至亞細胞級別、且高通量的檢測生物分子(例如核酸)的空間信息(例如，核酸的定位、分布和/或表達)的方法是十分必要的。
技術實現思路
1、為實現核酸的空間檢測，現有技術通過將陣列技術與高通量dna測序技術聯用，捕獲并定位標記組織樣本中的核酸，并對其進行測序和分析。為獲得能夠實現所述目的的芯片，現有技術通過點樣或微珠介導的方式將能夠捕獲核酸的探針固定于芯片。然而，使用微量體積點樣系統進行液滴平面點樣的點樣方式獲得的芯片的活性區域大小高達200微米，細胞觀測精度僅為20細胞；使用帶定位標記的微珠進行平面鋪展的微珠方式獲得的芯片的活性區域大小達10微米，細胞觀測精度僅能達到單細胞，無法實現對亞細胞的定位。本專利技術提供了一種全新的用于核酸空間檢測的核酸陣列及其制備方法、以及基于該陣列的核酸空間檢測方法，其能夠同時實現高精度亞細胞定位和高通量組織定位，具備重大應用價值。
2、核酸陣列的制備
3、在第一方面，本專利技術提供了一種產生用于檢測生物樣品中核酸的空間信息的核酸陣列的方法
4、(1)提供多種載體序列，每種載體序列包含多個拷貝的載體序列，所述載體序列從5’到3’的方向上包含：定位序列和第一固定序列，
5、所述定位序列具有與該種載體序列在陣列上的位置相對應的獨一無二的核苷酸序列；
6、所述第一固定序列允許與其互補的核苷酸序列發生退火并起始延伸反應；
7、(2)將所述多種載體序列連接于固相支持物(例如芯片)表面；
8、(3)提供第一引物，并以所述載體序列為模板，進行引物延伸反應，使得所述載體序列的第一固定序列和定位序列區域形成雙鏈，其中與所述載體序列雜交的鏈即為第一核酸分子，所述第一核酸分子從5’至3’方向上包含第一固定序列和定位序列的互補序列；其中，所述第一引物在其3’端包含第一固定序列互補區，所述第一固定序列互補區包含所述第一固定序列的互補序列或其片段，且具有3’自由端。
9、在某些實施方案中，所述載體序列、第一核酸分子是單鏈核酸序列。在某些實施方案中，所述載體序列、第一核酸分子是單鏈dna序列。
10、在某些實施方案中，在步驟(3)中，在進行延伸反應的同時，對所述載體序列進行測序，從而獲得所述載體序列所包含的定位序列的序列信息。
11、在某些實施方案中，在步驟(1)中通過以下步驟提供多種載體序列：
12、(i)提供多種載體模板序列，所述載體模板序列包含所述載體序列的互補序列；
13、(ii)以每種載體模板序列為模板，進行核酸擴增反應，以獲得每種載體模板序列的擴增產物，所述擴增產物包含多個拷貝的載體序列。
14、在某些實施方案中，所述擴增選自滾環復制(rca)、橋式pcr擴增、多重鏈置換擴增(mda)或乳液pcr擴增。
15、在某些實施方案中，進行滾環復制，以獲得由所述載體序列的多聯體所形成的dnb。在此類實施方案中，在步驟(i)中提供環狀模板序列。制備環狀核酸分子的方法是本領域的常規方法，本領域技術人員可以根據需要進行選擇，例如可以首先獲得線性核酸模板，然后通過連接酶(例如dna連接酶)實現線性核酸模板的環化。
16、在某些實施方案中，進行橋式pcr擴增、乳液pcr擴增或多重鏈置換擴增，以獲得由所述載體序列的克隆群形的dna簇。
17、在一些實施方案中，所述方法進一步包括以下步驟：
18、(4)提供第二核酸分子，所述第二核酸分子包含捕獲序列；
19、所述捕獲序列能夠與待捕獲核酸的全部或部分雜交，其包括：(a)能夠捕獲mrna的寡核苷酸序列；和/或，(b)隨機或簡并的寡核苷酸序列；或，(c)針對特定靶核酸的特異性序列；并且，所述捕獲序列具有3’自由端以使所述第二核酸分子能作為延伸引物，
20、(5)將所述第二核酸分子與所述第一核酸分子連接(例如，使用連接酶將所述第二核酸分子與第一核酸分子連接)。
21、在某些實施方案中，所述第二核酸分子是單鏈核酸序列。在某些實施方案中，所述第二核酸分子是單鏈dna序列。在某些實施方案中，所述第二核酸分子是單鏈rna序列。
22、在某些實施方案中，所述第二核酸分子從5’至3’方向上包含固定區和捕獲序列，所述固定區包含雙鏈核酸序列，例如雙鏈dna序列。在某些實施方案中，所述第二核酸分子所包含的捕獲序列是單鏈核酸序列，例如單鏈dna序列或單鏈rna序列。易于理解的是，在此類實施方案中，所述第二核酸分子具有部分雙鏈結構，也即，其固定區具有雙鏈結構，捕獲序列為單鏈結構。
23、在某些實施方案中，所述雙鏈核酸序列的長度為1bp-50bp，例如10bp-50bp，10bp-40bp或10bp-30bp。
24、在另一些實施方案中，所述方法進一步包括以下步驟：
25、(4)提供第二核酸分子，所述第二核酸分子從5’至3’方向上包含第二固定序列互補序列和捕獲序列；
26、所述第二固定序列互補序列允許與其互補的核苷酸序列發生雜交；
27、所述捕獲序列能夠與待捕獲核酸的全部或部分雜交，其包括：(a)能夠捕獲mrna的寡核苷酸序列；和/或，(b)隨機或簡并的寡核苷酸序列；或，(c)針對特定靶核酸的特異性序列；并且，所述捕獲序列具有3’自由端以使所述第二核酸分子能作為延伸引物；
28、(5)在允許退火的條件下使所述第二固定序列互補序列與第二固定序列發生雜交，從而將所述第二核酸分子連接至所述載體序列；
29、(6)任選地，將分別雜交在載體序列上的第一核酸分子和第二核酸分子連接(例如，使用連接酶將所述第二核酸分子與第一核酸分子連接)。
30、在此類實施方案中，每個載體序列在其5’端進一步包含第二固定序列，所述第二固定序列允許與其互補的核苷酸序列發生退火。在某些實施方案中，所述第二固定序列允許與其互補的核苷酸序列發生退火并起始延伸反應(例如可作為橋式pcr引物的結合位點)。
31、在某些實施方案中，所述第二核酸分子是單鏈核酸序列。在某些實施方案中，所述第二核酸分子是單鏈dna序列。在某些實施方案中，所述第二核酸分子是單鏈rna序列。
32、在某些實施方案中，所述第二固定序列與定位序列鄰接。
33、在某些實施方案中，所述第二固定序列的長度為1bp-50bp，例如10bp-50bp，10bp-40bp，10bp-30bp，或10bp-20bp。本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種細胞分類方法，所述方法包括：
2.一種細胞分類方法，所述方法包括：
3.權利要求1或2所述的方法，其中，所述方法具有選自下列的一項或多項特征：
4.權利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述方法在步驟(1)之前還包括步驟S1：
5.權利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述方法在步驟(1)之前還包括以下步驟：
6.權利要求4或5所述的方法，其中，所述載體序列的固定序列還包含切割位點，所述切割可以選自切刻酶(nicking?enzyme)酶切、USER酶切、光切除、化學切除或CRISPR切除；
7.權利要求4-6任一項所述的方法，在步驟S1之前進一步包括：
8.權利要求7任一項所述的方法，其中，所述多個拷貝的載體序列是由所述載體序列的多聯體所形成的DNB；
9.權利要求7任一項所述的方法，其中，所述多個拷貝的載體序列是由所述載體序列的克隆群形成的DNA簇；
10.權利要求1-9任一項所述的方法，其中，包含相同空間標簽序列的捕獲探針在所述固相支持物表面所占的面積的直徑小
11.權利要求1-10任一項所述的方法，其中，在步驟(2)之前，對所述空間標簽序列進行核酸檢測反應，獲得空間標簽序列信息；
12.權利要求4-11任一項所述的方法，其中，(a)進行所述引物延伸反應的同時，對所述載體序列進行測序，獲得所述載體序列所包含的空間標簽序列的序列信息；
13.權利要求1-12任一項所述的方法，其中，所述固相支持物是芯片；
14.權利要求1-13任一項所述的方法，其中，所述樣品為細胞樣品，和/或包含細胞的組織樣品；
15.權利要求4-14任一項所述的方法，其中，在步驟(1)中，所述載體序列包含：空間標簽序列的互補序列和固定序列；
16.權利要求4-15任一項所述的方法，其中，在步驟(2)中，所述捕獲探針以所述待測樣品的核酸為模板進行延伸反應，且所述延伸反應還包括以TSO序列為模板的進一步延伸，所述空間信息標記的核酸分子的3’端帶有TSO序列的互補序列。
17.權利要求4-16任一項所述的方法，其中，所述探針引物還包括切除區，從而由所述探針引物延伸獲得的第一核酸分子包括所述切除區；
18.權利要求4-17任一項所述的方法，其中，將所述探針引物固定在所述固相支持物表面；
19.權利要求18所述的方法，其中，所述連接子是能夠與活化基團(例如NH2)偶聯的連接基團，所述固相支持物表面具有活化基團(例如NH2)修飾；
20.權利要求4-19任一項所述的方法，其中，包含相同定位序列的載體序列在所述固相支持物表面所占的面積的直徑小于1微米；
...【技術特征摘要】
1.一種細胞分類方法，所述方法包括：
2.一種細胞分類方法，所述方法包括：
3.權利要求1或2所述的方法，其中，所述方法具有選自下列的一項或多項特征：
4.權利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述方法在步驟(1)之前還包括步驟s1：
5.權利要求1-3任一項所述的方法，其中，所述方法在步驟(1)之前還包括以下步驟：
6.權利要求4或5所述的方法，其中，所述載體序列的固定序列還包含切割位點，所述切割可以選自切刻酶(nicking?enzyme)酶切、user酶切、光切除、化學切除或crispr切除；
7.權利要求4-6任一項所述的方法，在步驟s1之前進一步包括：
8.權利要求7任一項所述的方法，其中，所述多個拷貝的載體序列是由所述載體序列的多聯體所形成的dnb；
9.權利要求7任一項所述的方法，其中，所述多個拷貝的載體序列是由所述載體序列的克隆群形成的dna簇；
10.權利要求1-9任一項所述的方法，其中，包含相同空間標簽序列的捕獲探針在所述固相支持物表面所占的面積的直徑小于1微米；優選地，所述每種捕獲探針(也即，包含相同空間標簽序列/空間標簽序列互補序列的捕獲探針)在所述固相支持物表面所占的面積(也即，活性區域)的直徑小于1微米。
11.權利要求1-10任一項所述的方法，其中，在步驟(2)之前，對所述空間標簽序列進行核酸檢測反應，獲得...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳奧，徐訊，楊晉，劉龍奇，王歐，黎宇翔，廖莎，唐國鑫，江媛，徐崇鈞，倪鳴，章文蔚，拉多杰·德馬納克，斯內扎娜·德馬納克，
申請(專利權)人：深圳華大生命科學研究院，
類型：發明
國別省市：
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