【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及cla97c06g112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，屬于基因功能驗(yàn)證和西瓜基因編輯的。
技術(shù)介紹
1、基因編輯(genome?editing)技術(shù)是一種能夠精確對(duì)生物體基因組的特定目標(biāo)基因進(jìn)行修飾的一門技術(shù)，其主要是利用序列的特異性核酸內(nèi)切酶剪切基因組的特定位點(diǎn)dna，從而形成dna雙鏈斷裂(double?strand?break，dsb)，而dna雙鏈斷裂后會(huì)激活生物體自身的修復(fù)機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)基因組的特異性改造。常見(jiàn)的核酸內(nèi)切酶主要要有：巨型核酸酶(meganuclease，megn)、鋅指核酸酶(zinc?finger?nucleases，zfn)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription?activator-like?effector?nucleases，talen)和成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)crispr(clustered?regularly?interspaced?short?palindromicrepeats)/cas(crispr-associated?protein)。其中，成簇規(guī)律性間隔短回文重復(fù)系統(tǒng)crispr/cas系統(tǒng)是細(xì)菌及古菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的一部分，它可特異性識(shí)別并降解進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的外源dna(噬菌體和質(zhì)粒等)，其主要由crispr序列和cas基因家族構(gòu)成，crispr序列是一種特殊dna重復(fù)序列，是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列，由一系列間隔序列和高度保守的正向重復(fù)序列相間排列而成，cas是一種核酸內(nèi)切酶，cas基因編碼的蛋白質(zhì)可以識(shí)別并且特異性切割外源
2、目前，crispr/cas是瓜類作物基因編輯中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，該技術(shù)在多基因編輯應(yīng)用方面更簡(jiǎn)單高效，僅需設(shè)計(jì)sgrna(single?guide?rna)，就能同時(shí)進(jìn)行多基因編輯，并且具有靶向精確、脫靶率低、細(xì)胞毒性低的優(yōu)勢(shì)。
3、2017年，許勇團(tuán)隊(duì)將crispr/cas9技術(shù)成功地應(yīng)用于西瓜物種中，定向敲除西瓜白化基因。2018年，tian等利用crispr/cas9技術(shù)對(duì)西瓜乙酰乳酸合酶(acetolactatesynthase，als)基因進(jìn)行編輯，最終共獲199株轉(zhuǎn)基因植株，成功建立了西瓜高效單堿基編輯體系，創(chuàng)制了抗除草劑苯磺隆的新種質(zhì)。2020年，zhang等利用crispr/cas9系統(tǒng)敲除編碼植物磺肽素前體的基因clpsk1，發(fā)現(xiàn)clpsk1功能的缺失能夠增強(qiáng)西瓜對(duì)枯萎病菌的抗性。同年，張?jiān)聠痰壤胏rispr/cas9技術(shù)編輯西瓜clwip1，成功創(chuàng)制了首例西瓜人工雌性株，為選育西瓜優(yōu)良雌性系提供理論和技術(shù)依據(jù)。2021年，zhang等通過(guò)crispr/cas9基因編輯技術(shù)，驗(yàn)證了clatm1在調(diào)控花藥發(fā)育中的功能以及在絨氈層發(fā)育中的自我調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)并克隆了西瓜中的第一個(gè)雄性不育基因。隨著西瓜全基因組測(cè)序的完成，其基因功能與性狀改良研究更是得到了快速地發(fā)展，西瓜成為了葫蘆科植物中第2個(gè)基因組編輯成功的物種。
4、西瓜種子的種殼木質(zhì)化對(duì)內(nèi)部胚胎的保護(hù)很重要，但是這種堅(jiān)硬的種殼組織不利于種子的萌發(fā)和進(jìn)一步加工利用。種殼發(fā)育過(guò)程長(zhǎng)，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，其種殼往往被視為無(wú)用的副產(chǎn)品，造成廢物處理問(wèn)題。因此，在現(xiàn)代育種計(jì)劃中，少殼已成為了大麥、玉米、豆類小麥等種子作物的重要育種性狀，而這種無(wú)殼性狀通常由單個(gè)或多個(gè)基因控制。目前，關(guān)于西瓜種殼的調(diào)控基因報(bào)道的極少，因此，開(kāi)發(fā)出新的能夠有效調(diào)控西瓜種殼的基因，對(duì)利用基因工程手段構(gòu)建薄種殼西瓜有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是提供cla97c06g112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，為現(xiàn)有技術(shù)提供一個(gè)能有效控制西瓜種殼薄厚的基因位點(diǎn)。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)中cla97c06g112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用所采用的技術(shù)方案是：
3、cla97c06g112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，所述cla97c06g112090基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
4、上述技術(shù)方案的有益效果在于：本專利技術(shù)cla97c06g112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用為開(kāi)拓性專利技術(shù)。本專利技術(shù)在前期研究定位了一個(gè)能調(diào)控西瓜種殼薄厚性狀的qtl區(qū)間，發(fā)現(xiàn)該區(qū)間中包含cla97c06g112090基因，且現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)該基因功能的研究較少。而本專利技術(shù)通過(guò)構(gòu)建cla97c06g112090基因的編輯載體，并將其轉(zhuǎn)化入西瓜植株中，研究cla97c06g112090基因的功能，對(duì)該基因進(jìn)行敲除后，能顯著降低西瓜種殼的厚度。本專利技術(shù)首次驗(yàn)證了cla97c06g112090基因參與西瓜種子的發(fā)育過(guò)程，敲除該基因后，西瓜種殼的厚度顯著變薄。
5、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，利用基因編輯技術(shù)，抑制西瓜中cla97c06g112090基因的表達(dá)，西瓜種子的種殼變薄。
6、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述抑制西瓜中cla97c06g112090基因的表達(dá)是構(gòu)建基因編輯載體，對(duì)cla97c06g112090基因進(jìn)行敲除。
7、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述基因編輯載體的構(gòu)建方法為根據(jù)cla97c06g112090基因設(shè)計(jì)基因編輯靶點(diǎn)，pcr擴(kuò)增后連接至pmd402-t載體上，測(cè)序鑒定。
8、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述基因編輯靶點(diǎn)的序列如下：
9、bar1：ccaaccgagctaccgcggct(如seq?id?no.4所示)；
10、bar2：ctggtcgtgacaaagtcatt(如seq?id?no.5所示)。
11、作為進(jìn)一步地改進(jìn)，所述西瓜的品種為“榆林”。
12、具體地，下述“榆林”簡(jiǎn)稱為“yl”，目前能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的西瓜品種較少，而“榆林”為能進(jìn)行轉(zhuǎn)化的、比較有代表性的西瓜品種。
本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.Cla97C06G112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述Cla97C06G112090基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cla97C06G112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：利用基因編輯技術(shù)，抑制西瓜中Cla97C06G112090基因的表達(dá)，西瓜種子的種殼變薄。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的Cla97C06G112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制西瓜中Cla97C06G112090基因的表達(dá)是構(gòu)建基因編輯載體，對(duì)Cla97C06G112090基因進(jìn)行敲除。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Cla97C06G112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述基因編輯載體的構(gòu)建方法為根據(jù)Cla97C06G112090基因設(shè)計(jì)基因編輯靶點(diǎn)，PCR擴(kuò)增后連接至pMD402-T載體上，測(cè)序鑒定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的Cla97C06G112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述基因編輯靶點(diǎn)的序列如下：p>
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項(xiàng)所述的Cla97C06G112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述西瓜的品種為“榆林”。
...【技術(shù)特征摘要】
1.cla97c06g112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述cla97c06g112090基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的cla97c06g112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：利用基因編輯技術(shù)，抑制西瓜中cla97c06g112090基因的表達(dá)，西瓜種子的種殼變薄。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的cla97c06g112090基因在創(chuàng)制薄種殼西瓜種質(zhì)中的應(yīng)用，其特征在于：所述抑制西瓜中cla97c06g112090基因的表達(dá)是構(gòu)建基因編輯載體，對(duì)cla97c06...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李燕歌，蔡秀秀，袁黎，許國(guó)奇，范樂(lè)萍，劉曼，朱忠厚，陳鑫兒，朱學(xué)杰，許肖云，王風(fēng)珍，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：洛陽(yáng)市農(nóng)發(fā)農(nóng)業(yè)科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。