【技術實現步驟摘要】
本公開一般涉及分析核酸如rna的領域，特別是確定樣品組合物的至少一個參數，所述樣品組合物包含核酸(尤其是rna)和任選存在的顆粒。
技術介紹
1、使用重組核酸(如dna或rna)將外源遺傳信息遞送至靶細胞中是眾所周知的。使用rna的優點包括瞬時表達和非轉化特征。rna不需要進入細胞核就可以表達，而且不可以整合至宿主基因組中，從而消除了各種風險如腫瘤發生。
2、重組核酸可以裸露形式給藥于有此需要的受試者；然而，重組核酸通常使用藥物組合物給藥。例如，rna可以通過所謂的納米顆粒制劑遞送，所述納米顆粒制劑含有rna和形成納米顆粒的媒介物，例如，陽離子脂質、陽離子脂質和輔助脂質的混合物或者陽離子聚合物。
3、這類納米顆粒制劑的命運受各種關鍵因素控制(例如，納米顆粒中核酸的完整性和濃度；游離核酸的量；納米顆粒的大小、大小分布、定量大小分布和形態；等等)。例如，這些因素在2018年的fda"liposome?drug?products?guidance"中被稱作應當分析和具體說明的特定屬性。當前納米顆粒制劑的臨床應用的局限性可能在于缺少均質、純凈和良好表征的納米顆粒制劑。這也是由于所有用于確定這些因素的現有技術都存在一些缺點。
4、例如，目前用于確定納米顆粒中核酸的完整性和/或濃度的技術(如基于染料、凝膠電泳、微通道電泳或毛細管電泳(ce))是勞動密集型的、昂貴的、利用樣品制備步驟導致假象，不可以提供足夠信息和/或不可以分析大量樣品。在目前使用染料(如熒光染料)的一種技術中，染料本身可以導致差異，這可以影
5、此外，表征納米顆粒制劑的一個關鍵挑戰在于對制劑中含有的顆粒的大小分布的定量確定。對于直徑小于約500nm(即與大多數醫藥產品相關的范圍)的顆粒尤其如此。另一個未滿足的需求在于確定納米顆粒制劑的大小分布，其中大小分布寬或復雜(特別是不對稱)。可用于表征納米顆粒制劑的所有現有技術都具有某些缺點：例如，它們不提供關于大小的直接定量信息，或者它們僅測量小的、任選不具有代表性的樣品子集，或者對具有不同大小的顆粒的靈敏度(或其他參數，例如，相對于體相的折射率梯度)非常不同，這強烈影響獲得的大小分布。
6、關于在較低亞微米范圍(約100nm)中的顆粒的大小測量，存在幾種技術，如動態光散射(dls)、納米顆粒跟蹤分析(nta)、電子顯微術(em)和大小排阻色譜(sec)-uv。
7、dls提供關于納米顆粒的擴散常數的信息，由此使用stokes-einstein方程計算流體動力學半徑rh。但是，dls僅提供平均數據，由此使用某些算法數值計算顆粒大小。為了獲得定量可靠的數字，納米顆粒制劑應當是單峰和單分散的，這對于許多產品而言并非如此，包括納米顆粒藥物制劑。在dls中最廣泛使用的算法是所謂的累積分析(d.e.koppel,j.chem.phys.57(1972)4814-4820)，作為前提，其僅假設單峰大小分布，并且僅在多分散性低于某個閾值的情況下提供具有物理意義的數字。dls的其他算法(參見，例如，provencher,s.w.,comput.phys.commun.1982,27,229–242)提供大小曲線，其主要取決于擬合參數，并且幾個非常不同的譜可以對應于相同的數據集。這種分析受到以下事實的阻礙：大顆粒的光散射強度遠高于較小顆粒，這使得在大得多的顆粒的存在下難以確定較小顆粒的分數。
8、nta是一種通過隨著時間的推移用顯微鏡觀察來自樣品的非常小的(稀釋的)子集的散射光來從它們的擴散常數確定顆粒大小的方法。原則上，nta能夠提供定量的大小分布譜；但是，只可以測量非常稀釋的樣品，并且顆粒必須存在于相對較小的大小范圍中，即，由于散射強度高得多，因此不可以在大得多的背景下確定非常小的顆粒。因此，nta不適合作為確定藥物制劑的定量大小分布的常規方法。此外，與其他技術(例如，dls)相比，nta的統計標準差較高。這是nta分析的顆粒量低一到三個數量級的直接結果。特別地，具有生物學影響的微量顆粒(例如，聚集體)可能被低估，或者甚至無法通過nta檢測到。nta需要幾個耗時的優化步驟(例如，視頻捕獲設置、不同的樣品稀釋等)以確定適合準確測量的設置。通常，用于nta測量的樣品必須稀釋10-1000倍，這可能會導致問題，特別是顆粒的取決于濃度的聚集或分解。由于所有這些缺點，很難將nta建立為質量控制方法。
9、em提供關于單個顆粒的大小、形狀和形態的定量信息，但是可以分析的顆粒數量甚至低于nta。因此，在測量的顆粒可能不代表整個樣品的意義上，em具有與nta相似或相同的缺點。這種技術的其他主要缺點是成本高、樣品制備復雜和分析樣品的周轉時間長。這就是為什么em不常用作gmp方法的原因。em的另一個問題是樣品的固定會導致假象(例如，收縮、聚集等)。如果樣品未固定(例如，在cryo-em中)，則樣品可能具有低對比度，并且無法分析。
10、其他分離技術如sec-uv不適用，因為與柱基質的相互作用會導致問題(例如，吸附或洗脫延遲)。由于sec柱的大小范圍有限，納米顆粒不可以充分分散，或者納米顆粒不可以與聚集體分離。此外，在質量或顆粒數量與顆粒大小直接相關的意義上，sec-uv不提供定量的大小分布。其他分散方法如分析超速離心(auc)僅允許間接大小測量，例如基于沉降系數，其中必須做出幾個假設以計算大小分布。此外，auc既昂貴又費時，并且它不是常規質量控制中的常用方法。因此，auc也不適合作為常規質量控制方法用于確定定量大小譜。
11、鑒于上述情況，為了確保納米顆粒制劑的可重復質量，需要用于深入顆粒表征的先進分析方法。特別地，需要一種改進的分析含有核酸(尤其是rna)的納米顆粒制劑的方法，其中所述方法優選地(i)提供關于制劑特征的信息(如制劑中含有的顆粒的定量大小分布(特別是對于直徑小于500nm的顆粒)；(ii)提供關于顆粒組成特征的信息(例如，顆粒中含有的核酸(尤其是rna)的量，特別是作為顆粒大小的函數，如顆粒中含有的核酸(尤其是rna)的量與顆粒形成化合物(特別是脂質和/或聚合物，例如，陽離子脂質對陽離子聚合物)的量的比例，特別是作為顆粒大小的函數)；(iii)與gmp兼容；(iv)不依賴于染料的使用；(v)是半自動的；和/或(vi)可以用來分析當制備和/或儲存組合物時改變一個或多個反應條件的影響(例如，鹽濃度；溫度；本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于確定樣品組合物的一個或多個參數的方法，其中所述樣品組合物包含RNA和與RNA結合的顆粒，所述方法包括：
2.場-流分級在確定樣品組合物的一個或多個參數中的用途，所述樣品組合物包含RNA和與RNA結合的顆粒，其中所述一個或多個參數包括RNA完整性、RNA的總量、游離RNA的量、與顆粒結合的RNA的量、含有RNA的顆粒的大小(如含有RNA的顆粒的流體動力學半徑)、含有RNA的顆粒的大小分布以及含有RNA的顆粒的定量大小分布，其中確定至少兩個選自以下的參數：游離RNA的量、與顆粒結合的RNA的量、含有RNA的顆粒的大小分布以及含有RNA的顆粒的定量大小分布。
3.權利要求2的用途，其中所述場-流分級包括：
4.權利要求1的方法或者權利要求2或3的用途，其中所述場-流分級是流場-流分級，如非對稱流場-流分級(AF4)或中空纖維流場-流分級(HF5)。
5.權利要求1或4的方法或者權利要求3或4的用途，其中使用以下進行步驟(a)：
6.權利要求1、4和5中任一項的方法或者權利要求2-5中任一項的用途，其中使用對照RNA
7.權利要求1和4-6中任一項的方法或者權利要求2-6中任一項的用途，其中所述與RNA結合的顆粒為脂質復合物顆粒和/或脂質納米顆粒和/或polyplex顆粒和/或脂質多聚復合物顆粒和/或病毒樣顆粒。
8.權利要求1和4-7中任一項的方法或者權利要求3-7中任一項的用途，
9.權利要求1和4-8中任一項的方法或者權利要求3-8中任一項的用途，其中步驟(b)進一步包括測量從步驟(a)獲得的一個或多個樣品級分中至少一個的LS信號，如動態光散射(DLS)信號和/或靜態光散射(SLS)，例如，多角度光散射(MALS)信號，其中，優選地，
10.權利要求1和4-9中任一項的方法或者權利要求2-9中任一項的用途，
11.權利要求1和4-10中任一項的方法或者權利要求2-10中任一項的用途，其中
12.權利要求1和4-11中任一項的方法或者權利要求2-11中任一項的用途，其中在使所述樣品組合物的至少部分進行場-流分級之前，將所述樣品組合物的所述至少部分用溶劑或溶劑混合物稀釋，所述溶劑或溶劑混合物能夠防止顆粒聚集體的形成，其中，優選地，所述溶劑混合物是水和有機溶劑如甲酰胺的混合物。
13.權利要求1和4-12中任一項的方法或者權利要求2-12中任一項的用途，其中測量UV信號是通過使用圓二色(CD)光譜來進行的。
14.一種分析在提供包含RNA和與RNA結合的顆粒的組合物時改變一個或多個反應條件的影響的方法，所述方法包括：
15.權利要求14的方法，其中所述一個或多個反應條件包括以下任一個：鹽濃度/離子強度(例如，2mM?NaCl或100mM?NaCl)；溫度(例如，低溫(如-20℃)或高溫(如50℃))；pH或緩沖液濃度；光/輻射；氧；剪切力；壓力；冷凍/解凍循環；干燥/復原循環；添加賦形劑(例如，穩定劑和/或螯合劑)；顆粒形成化合物(特別是脂質和/或聚合物，例如，陽離子脂質對兩性離子脂質或聚乙二醇化脂質對非聚乙二醇化脂質)的類型和/或來源；電荷比；物理狀態；以及RNA與顆粒形成化合物(特別是脂質和/或聚合物)的比例。
...【技術特征摘要】
1.一種用于確定樣品組合物的一個或多個參數的方法，其中所述樣品組合物包含rna和與rna結合的顆粒，所述方法包括：
2.場-流分級在確定樣品組合物的一個或多個參數中的用途，所述樣品組合物包含rna和與rna結合的顆粒，其中所述一個或多個參數包括rna完整性、rna的總量、游離rna的量、與顆粒結合的rna的量、含有rna的顆粒的大小(如含有rna的顆粒的流體動力學半徑)、含有rna的顆粒的大小分布以及含有rna的顆粒的定量大小分布，其中確定至少兩個選自以下的參數：游離rna的量、與顆粒結合的rna的量、含有rna的顆粒的大小分布以及含有rna的顆粒的定量大小分布。
3.權利要求2的用途，其中所述場-流分級包括：
4.權利要求1的方法或者權利要求2或3的用途，其中所述場-流分級是流場-流分級，如非對稱流場-流分級(af4)或中空纖維流場-流分級(hf5)。
5.權利要求1或4的方法或者權利要求3或4的用途，其中使用以下進行步驟(a)：
6.權利要求1、4和5中任一項的方法或者權利要求2-5中任一項的用途，其中使用對照rna的完整性計算或確定所述樣品組合物中含有的rna的完整性；優選地，其中
7.權利要求1和4-6中任一項的方法或者權利要求2-6中任一項的用途，其中所述與rna結合的顆粒為脂質復合物顆粒和/或脂質納米顆粒和/或polyplex顆粒和/或脂質多聚復合物顆粒和/或病毒樣顆粒。
8.權利要求1和4-7中任一項的方法或者權利要求3-7中任一項的用途，
9.權利要求1和4-8中任一項的方法或者權利要求3-8中任一項的用途，其中步驟(...
【專利技術屬性】
技術研發人員：H·哈斯，T·巴齊克，J·舒馬赫，
申請(專利權)人：生物技術歐洲股份公司，
類型：發明
國別省市：
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