【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
專利
本文提供用于利用熒光蛋白以裝置檢測蛋白合成的方法和組合物。所述方法適用于在微流體裝置上的監(jiān)測。
技術(shù)介紹
0、專利技術(shù)背景
1、當(dāng)在微流體裝置，諸如數(shù)字微流體裝置中以微流體規(guī)模進(jìn)行無細(xì)胞蛋白合成時(shí)，實(shí)時(shí)檢測由所述無細(xì)胞蛋白合成反應(yīng)合成的蛋白是有用的。然而，在無細(xì)胞蛋白合成反應(yīng)環(huán)境中進(jìn)行蛋白的實(shí)時(shí)檢測是困難的。反應(yīng)含有高濃度的許多其它蛋白和生物分子，使得通過標(biāo)準(zhǔn)的蛋白染色方法(例如考馬斯亮藍(lán)g-250、syprotm?ruby、銀染色)的非特異性蛋白檢測困難。免疫染色或基于親和力的純化接著進(jìn)行非特異性蛋白染色同樣無濟(jì)于事，因?yàn)楸仨氃诠腆w支持物上進(jìn)行大量洗滌以防止背景干擾。由于已知在微流體和數(shù)字微流體裝置中洗滌是困難的，背景干擾可能變得令人困擾。
2、目前現(xiàn)有的發(fā)光互補(bǔ)方法不能在無細(xì)胞蛋白合成反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)長期的實(shí)時(shí)檢測，無細(xì)胞蛋白合成反應(yīng)往往超過16小時(shí)。這種限制是由于多種原因造成的，包括與無細(xì)胞蛋白合成o2需求相競爭的發(fā)光酶的o2消耗以及在重組蛋白表達(dá)檢測的3-24小時(shí)內(nèi)發(fā)光底物的暫時(shí)或永久耗盡。
3、所關(guān)注的蛋白也可以表達(dá)為與熒光蛋白，諸如綠色熒光蛋白(gfp)的融合體。然而，gfp是26.9kda的蛋白，這是大多數(shù)熒光蛋白的典型尺寸。該尺寸的標(biāo)簽增加所關(guān)注的蛋白的總尺寸，特別是如果所關(guān)注的蛋白必須用其它大的融合蛋白，諸如42.5kda的麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)標(biāo)記。鑒于人蛋白的平均尺寸是約52kda，并且大腸桿菌蛋白的平均尺寸是約35kda(kim，y.e.等人，annu.rev.
4、許多現(xiàn)有技術(shù)公開子組分標(biāo)簽用于監(jiān)測細(xì)胞系統(tǒng)中的表達(dá)的用途。例如，us7,666,606公開使用微結(jié)構(gòu)域的蛋白-蛋白相互作用的檢測系統(tǒng)。
5、schinn等人，biotechnol.bioeng?114102017年10月，2412-2417(https：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/bit.26305)公開快速體外篩選非天然氨基酸對(duì)蛋白表達(dá)和活性的位置依賴性影響-schinn-2017-biotechnology?and?bioengineering-wiley?online?library。
6、分開的(split)綠色熒光蛋白(gfp)已被用于多種應(yīng)用。ccgfp是一種由在紅寶石香菇珊瑚(corynactis?califomica)中發(fā)現(xiàn)的四聚體gfp工程化而成的綠色熒光蛋白，紅寶石香菇珊瑚是一種類似于海葵和石珊瑚(scleractinian?stony?corals)的鮮紅色的集群的珊瑚蟲，如nguyen等人；nature?scientific?reports?volume?11，article?number：18440(2021)中所述。本專利技術(shù)人在本文中已經(jīng)優(yōu)化了ccgfp用于無細(xì)胞蛋白合成的用途。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
0、專利技術(shù)概述
1、分開的ccgfp變體可用作用于檢測所關(guān)注的蛋白的通用方法，所述所關(guān)注的蛋白在其編碼序列的任一端包含ccgfp11v1肽。使用先前描述的分開的ccgfp系統(tǒng)的缺點(diǎn)是蛋白的溶解度低，使得必須從包涵體中純化蛋白，并限制可用于檢測試驗(yàn)的工作濃度。
2、本專利技術(shù)在此描述了改進(jìn)型ccgfp變體氨基酸序列及其組分、用于其表達(dá)的核酸序列以及改進(jìn)型熒光蛋白的用途。可以修飾與鏈11相鄰的鏈的突變以改善蛋白的性質(zhì)。β-桶形鏈(beta-barrel?strand)3和10與鏈11有h鍵相互作用。這些變化不應(yīng)破壞gfp1-10：gfp11互補(bǔ)，但可以改變分開的gfp的暴露的疏水核，這可能是不溶性表達(dá)的原因。
3、ccgfp1-11野生型氨基酸序列為221個(gè)氨基酸(鏈3有下劃線)：
4、
5、公開一種在鏈3區(qū)gqktlklrv(殘基40-48)具有突變的ccgfp1-11序列。公開一種在位置k45處具有突變的ccgfp1-11序列，該突變可以是k45e。公開一種具有位置45e的與以下序列具有至少90％同源性的氨基酸序列：
6、
7、
8、該序列可以以分開的形式使用，例如作為ccgfp11和ccgfp1-10使用。所述序列可以被截短，使得可以從n或c端去除氨基酸，而不影響折疊的核的活性或熒光。當(dāng)序列被截短時(shí)，修飾的位置可能改變編號(hào)，對(duì)k45的提及是指221個(gè)氨基酸的野生型序列。對(duì)鏈3的提及是指221個(gè)氨基酸的野生型序列的氨基酸40-48。
9、鏈3氨基酸變化產(chǎn)生有前景的氨基酸變化位置。氨基酸位置的一個(gè)實(shí)例是k45。這可以改為k45e。鏈3序列可包含geqelelrv。
10、描述了特定的ccgfp1-10變體k45e。一旦與ccgfp11混合，它將與ccgfp11結(jié)合，補(bǔ)充缺失的β折疊(beta?sheet)11，產(chǎn)生可檢測和量化的熒光信號(hào)。這實(shí)現(xiàn)在體外和體內(nèi)檢測ccgfp11標(biāo)記的蛋白。與原始ccgfp1-10親本相比，此處描述的ccgfp1-10k45e蛋白變體顯示提高的溶解度。通過添加c端mbp融合蛋白可以進(jìn)一步提高溶解度。
11、本文的變化改善蛋白的物理性質(zhì)(例如溶解度；互補(bǔ)率)，而不影響其他性質(zhì)(例如熒光的顏色；分開的鏈的序列等)。例如，親本ccgfp1-100在表達(dá)時(shí)可溶性為5-10％。本文描述的突變將其增加到約55％。添加mbp作為融合蛋白甚至進(jìn)一步提高溶解度。親本蛋白(27kda)在濃度超過1mg/ml時(shí)引起沉淀。使用本文所述的變體，突變蛋白在其洗脫緩沖液中可被濃縮至65mg/ml，而沒有明顯的沉淀。這種較高的濃度實(shí)現(xiàn)在少量液體中進(jìn)行原位(實(shí)時(shí)和終點(diǎn))檢測的直接應(yīng)用，而不需要大量的最終稀釋以添加足夠的蛋白進(jìn)行終點(diǎn)讀數(shù)。
12、這里，我們報(bào)告了改進(jìn)型分開的肽系統(tǒng)在無細(xì)胞蛋白合成反應(yīng)中基于熒光監(jiān)測所關(guān)注的蛋白的表達(dá)的用途。監(jiān)測可以實(shí)時(shí)進(jìn)行，以及提供終點(diǎn)測量。
13、本文公開一種包含k45e突變的ccgfp變體。該變體可以是ccgfp1-10變體或ccgfp1-11變體。所述ccgfp1-10變體可以與ccgfp11變體復(fù)合。
14、ccgfp1-10k45e變體序列可以包含以下序列：
15、
16、
17、有下劃線的e是野生型k的改變位點(diǎn)
18、
19、蛋白ccgfp?k45e變體序列可以包含與具有固定的e的序列具有大于95％同源性的序列：
20、
21、或其c端或n端截短，其與ccgfp11結(jié)合以發(fā)出熒光。
22、該蛋白具有高度可溶性。可以以大于10mg/ml的濃度使用突變蛋白。可以以大于50mg/ml的濃度使用突變蛋白。可以以大于65mg/ml的濃度使用突變蛋白。蛋白可以連接到另外的序列，諸如麥芽糖結(jié)合蛋白(mb本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種ccGFP變體，其包含β鏈3的一個(gè)或多個(gè)突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ccGFP變體，其包含K45突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ccGFP變體，其包含K45E突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的ccGFP變體，其是ccGFP1-10變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的ccGFP變體，其中所述ccGFP1-10與ccGFP11復(fù)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的變體，其中所述ccGFP?K45E變體序列包含與以下具有固定的E的序列具有大于95％的同源性的序列：
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的變體，其中所述ccGFP?K45E變體序列包含序列：
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的變體，其進(jìn)一步包含溶解度增強(qiáng)序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的變體，其中所述溶解度增強(qiáng)序列選自谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、小泛素樣修飾蛋白(SUMO)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、肝片吸蟲8kDa抗原(FH8)、硫氧還蛋白(TRX)、溶解度增強(qiáng)泛在標(biāo)簽(Solubility?Enhan
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的變體，其包含選自以下的序列：
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的變體，其中所述蛋白的濃度大于10mg/mL。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的變體，其中所述蛋白的濃度大于50mg/mL。
13.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的氨基酸序列的核酸序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的核酸序列，其包含：
15.一種檢測所關(guān)注的蛋白的方法，其包括取連接到ccGFP11的所關(guān)注的蛋白，將ccGFP11與根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)所述的ccGFP1-10變體結(jié)合，并通過檢測來自組裝的ccGFP1-11的熒光信號(hào)來監(jiān)測所關(guān)注的蛋白的存在。
16.一種用于通過在根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)所述的ccGFP1-10變體的存在下表達(dá)所關(guān)注的蛋白(POI)提高所表達(dá)的POI的可溶性產(chǎn)量的方法，所述ccGFP1-10變體與連接到POI的ccGFP11結(jié)合序列結(jié)合。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或權(quán)利要求16所述的方法，其中在數(shù)字微流體裝置上的液滴中進(jìn)行連接到ccGFP11的所關(guān)注的蛋白的表達(dá)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其包括在根據(jù)權(quán)利要求4或權(quán)利要求6至10中任一項(xiàng)所述的ccGFP1-10存在下，在數(shù)字微流體裝置上的液滴中表達(dá)連接到ccGFP11的蛋白，并通過檢測來自組裝的ccGFP1-11的熒光信號(hào)來監(jiān)測所關(guān)注的蛋白的存在。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或權(quán)利要求18所述的方法，其中所述數(shù)字微流體裝置是基于有源矩陣薄膜晶體管(AM-TFT)的裝置。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述數(shù)字微流體裝置包括兩個(gè)平行板，所述兩個(gè)平行板被間隔物隔開以限定填充有疏水性液體或非離子液體的流體體積。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述蛋白處于油層中的水性液滴中，并且所述疏水性液體或非離子液體含有表面活性劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述表面活性劑為脫水山梨糖醇酯。
23.根據(jù)權(quán)利要求20-23中任一項(xiàng)所述的方法，其中疏水性液體或非離子液體是癸烷、十二烷或十二甲基五硅氧烷。
...【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
1.一種ccgfp變體，其包含β鏈3的一個(gè)或多個(gè)突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ccgfp變體，其包含k45突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的ccgfp變體，其包含k45e突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的ccgfp變體，其是ccgfp1-10變體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的ccgfp變體，其中所述ccgfp1-10與ccgfp11復(fù)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的變體，其中所述ccgfp?k45e變體序列包含與以下具有固定的e的序列具有大于95％的同源性的序列：
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的變體，其中所述ccgfp?k45e變體序列包含序列：
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的變體，其進(jìn)一步包含溶解度增強(qiáng)序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的變體，其中所述溶解度增強(qiáng)序列選自谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)、小泛素樣修飾蛋白(sumo)、麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)、肝片吸蟲8kda抗原(fh8)、硫氧還蛋白(trx)、溶解度增強(qiáng)泛在標(biāo)簽(solubility?enhancing?ubiquitous?tag，snut)、十七千道爾頓蛋白(skp)、單體噬菌體t7orc蛋白(mocr)、大腸桿菌分泌的蛋白a(espa)、t7噬菌體尾(p17)、金屬結(jié)合蛋白(cusf)或53個(gè)氨基酸長的n端延伸序列(next)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的變體，其包含選自以下的序列：
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的變體，其中所述蛋白的濃度大于10mg/ml。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的變體，其中所述蛋白的濃度大于50mg/ml。
13.編碼根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的氨基酸序列的核酸序列。
...【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：F·米特爾伯格，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：核蛋白有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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