【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子標(biāo)記，具體涉及一種新的分子標(biāo)記的開發(fā)方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，羊肉消費(fèi)在人們?nèi)粘ＯM(fèi)中的占比逐漸擴(kuò)大，羊肉產(chǎn)量成為制約綿羊經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要因素。生長(zhǎng)性狀是綿羊最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，與羊肉產(chǎn)量息息相關(guān)，因此培育具有優(yōu)秀生長(zhǎng)性狀的綿羊是解決當(dāng)前綿羊業(yè)問題的重要方法。
2、分子標(biāo)記(molecularmarkers)屬于遺傳標(biāo)記的一種，可以直接反映生物體在dna水平上的遺傳特征。常見的分子標(biāo)記有snp、rflp、ssr等。相對(duì)于其他的分子標(biāo)記，snp標(biāo)記具有變異信息豐富、穩(wěn)定性高、適用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，是現(xiàn)在最常使用的分子標(biāo)記。通過分子標(biāo)記使用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)(mas)可以加快綿羊的培育過程。
3、華蒙肉羊是由內(nèi)蒙古富川養(yǎng)殖科技有限公司聯(lián)合內(nèi)蒙古大學(xué)、內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院等高校和科研院所以白頭杜泊羊、小尾寒羊和蒙古羊經(jīng)過雜交改良、橫交固定、選育提高等階段，培育出的肉用綿羊新品種。因此對(duì)華蒙肉羊生長(zhǎng)性狀方面的研究較少。通過識(shí)別和鑒定華蒙肉羊重要的snp標(biāo)記可以加速華蒙肉羊生長(zhǎng)性狀的遺傳改良過程、提升華蒙肉羊生產(chǎn)量，還可以為探究綿羊的遺傳特性、基因功能和遺傳機(jī)制提供重要信息。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)提供了一種新的分子標(biāo)記的開發(fā)方法及應(yīng)用，為探究目標(biāo)性狀的多態(tài)性和功能提供思路，并可用于分子標(biāo)記輔助育種，有效提升待測(cè)物種的生產(chǎn)力。
2、為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了一種分子標(biāo)記開發(fā)方法，包括以下步驟：(1)根據(jù)待
3、(2)針對(duì)步驟(1)獲取的新snps位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，使用flu-arms分型方法對(duì)待測(cè)物種的篩選樣本進(jìn)行基因分型，獲得篩選樣本的基因型數(shù)據(jù)；
4、(3)對(duì)步驟(2)得到的所述基因型數(shù)據(jù)對(duì)所述待測(cè)物種的篩選樣本進(jìn)行群體遺傳分析，并與所述目標(biāo)事件相關(guān)的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得與目標(biāo)事件顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記。
5、本專利技術(shù)一個(gè)優(yōu)選方式中，步驟(1)所述待測(cè)物種包括綿羊；
6、所述目標(biāo)事件相關(guān)的已知基因包括與體重和/或生長(zhǎng)性狀相關(guān)的基因。
7、本專利技術(shù)一個(gè)優(yōu)選方式中，包括以所述目標(biāo)事件相關(guān)的已知基因中的變異位點(diǎn)為中心，取上游和下游各400bp為參考序列，設(shè)計(jì)普通引物。
8、本專利技術(shù)一個(gè)優(yōu)選方式中，步驟(2)中以所述新snps位點(diǎn)的變異位點(diǎn)為中心，取基因組上游和下游各200bp為參考序列，設(shè)計(jì)所述特異性引物。
9、本專利技術(shù)一個(gè)優(yōu)選方式中，利用所述特異性引物進(jìn)行touchdownpcr擴(kuò)增；
10、所述touchdownpcr擴(kuò)增的程序，包括：95℃預(yù)變性10min；95℃變性15s，61℃→55℃退火1min，每循環(huán)降溫0.6℃，10個(gè)循環(huán)；95℃變性15s，55℃～65℃退火1min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。
11、本專利技術(shù)還提供了基于上述分子標(biāo)記開發(fā)方法開發(fā)得到的分子標(biāo)記序列。
12、本專利技術(shù)一個(gè)優(yōu)選方式中，所述分子標(biāo)記序列包括華蒙肉羊g.97048094a＞c和g.51238a＞g。
13、本專利技術(shù)還提供了一組根據(jù)上述分子標(biāo)記序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)，包括針對(duì)華蒙肉羊g.97048094a＞c設(shè)計(jì)的引物對(duì)，核苷酸序列如seq?id?no.1、seq?id?no.2和seq?id?no.3所示；
14、針對(duì)華蒙肉羊g.51238a＞g設(shè)計(jì)的引物對(duì)，核苷酸序列如seq?id?no.4、seq?idno.5和seq?id?no.6所示。
15、本專利技術(shù)還提供了基于上述分子標(biāo)記開發(fā)方法開發(fā)得到的分子標(biāo)記序列在待測(cè)物種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。
16、本專利技術(shù)還提供了基于上述分子標(biāo)記開發(fā)方法開發(fā)得到的分子標(biāo)記序列在分子標(biāo)記輔助新品種選育中的應(yīng)用。
17、有益效果：本專利技術(shù)提供了一種分子標(biāo)記開發(fā)方法根據(jù)gwas結(jié)果提供的顯著變異位點(diǎn)，在顯著變異位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)普通引物，并進(jìn)行sanger測(cè)序發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行基因分型和關(guān)聯(lián)分析等加以驗(yàn)證，從而得到全新的分子標(biāo)記。本專利技術(shù)實(shí)施例中以403只華蒙肉羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)對(duì)象，根據(jù)圖1所示流程挖掘與體重性狀相關(guān)基因的多態(tài)性；針對(duì)loc101122263、zmynd8和prame三個(gè)與綿羊生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的基因設(shè)計(jì)14條普通引物；為了獲得最準(zhǔn)確的變異位點(diǎn)，通過混合pcr擴(kuò)增及sanger測(cè)序，獲得了11個(gè)新的snps位點(diǎn)；通過設(shè)計(jì)特異性引物，使用flu-arms分型技術(shù)對(duì)華蒙肉羊的dna樣本進(jìn)行基因分型，得到了403只實(shí)驗(yàn)羊群體的基因型數(shù)據(jù)；基于分型結(jié)果對(duì)華蒙肉羊?qū)嶒?yàn)群體進(jìn)行群體遺傳分析，并與表型數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到了2個(gè)與生長(zhǎng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記g.97048094a＞c和g.51238a＞g，功能性分子標(biāo)記開發(fā)率達(dá)到18％以上。與dcasp、rflp技術(shù)、rapd技術(shù)等相比，本專利技術(shù)采用的方法發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)數(shù)量較多，對(duì)實(shí)驗(yàn)器材要求相對(duì)較低，實(shí)驗(yàn)流程相對(duì)簡(jiǎn)單，結(jié)果導(dǎo)向更加精準(zhǔn)，目的性更強(qiáng)，開發(fā)的分子標(biāo)記也較為顯著。利用本專利技術(shù)所述方法篩選得到的全新分子標(biāo)記，為華蒙肉羊的遺傳育種提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為加速綿羊新品種選育提供新思路。
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1.一種分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)根據(jù)待測(cè)物種與目標(biāo)事件相關(guān)的已知基因設(shè)計(jì)若干條普通引物，通過混合PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，獲取新的SNPs位點(diǎn)；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，步驟(1)所述待測(cè)物種包括綿羊；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，包括以所述目標(biāo)事件相關(guān)的已知基因中的變異位點(diǎn)為中心，取上游和下游各400bp為參考序列，設(shè)計(jì)普通引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，步驟(2)中以所述新SNPs位點(diǎn)的變異位點(diǎn)為中心，取基因組上游和下游各200bp為參考序列，設(shè)計(jì)所述特異性引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，利用所述特異性引物進(jìn)行TouchdownPCR擴(kuò)增；
6.基于權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述分子標(biāo)記開發(fā)方法開發(fā)得到的分子標(biāo)記序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述分子標(biāo)記序列，其特征在于，所述分子標(biāo)記序列包括華蒙肉羊g.97048094A＞C和g.51238A＞G。
8.一組根據(jù)權(quán)利要
9.基于權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述分子標(biāo)記開發(fā)方法開發(fā)得到的分子標(biāo)記序列在待測(cè)物種遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。
10.基于權(quán)利要求1～5任一項(xiàng)所述分子標(biāo)記開發(fā)方法開發(fā)得到的分子標(biāo)記序列在分子標(biāo)記輔助新品種選育中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，包括以下步驟：(1)根據(jù)待測(cè)物種與目標(biāo)事件相關(guān)的已知基因設(shè)計(jì)若干條普通引物，通過混合pcr擴(kuò)增及sanger測(cè)序，獲取新的snps位點(diǎn)；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，步驟(1)所述待測(cè)物種包括綿羊；
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，包括以所述目標(biāo)事件相關(guān)的已知基因中的變異位點(diǎn)為中心，取上游和下游各400bp為參考序列，設(shè)計(jì)普通引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，步驟(2)中以所述新snps位點(diǎn)的變異位點(diǎn)為中心，取基因組上游和下游各200bp為參考序列，設(shè)計(jì)所述特異性引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述分子標(biāo)記開發(fā)方法，其特征在于，利用所述特異性引物進(jìn)行tou...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：付紹印，劉永斌，何小龍，王韻斐，王標(biāo)，達(dá)賴，陳秋菊，特日格勒，周璇，劉敏，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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