【技術實現步驟摘要】
本申請涉及中藥鑒別，特別涉及一種多重pcr鑒別石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提物制劑的方法和應用。
技術介紹
1、《中國藥典》(2020年版)規定石菖蒲來源為天南星科植物石菖蒲acorustatarinowii?schott的干燥根莖，秋、冬二季采挖，除去須根和泥沙，曬干，氣芳香，味苦、微辛，主治開竅豁痰，醒神益智，化濕開胃，臨床上用于健忘失眠、耳鳴耳聾、神昏癲癇、脘痞不饑、噤口下痢。金錢蒲為天南星科植物金錢蒲acorus?gramineus?soland，其中香葉菖蒲acorus?xiangyeus、茴香菖蒲acorus?macrospadiceus、acorus?latifolius寬葉菖蒲是金錢蒲acorus?gramineus的異名，植物智(植物智慧信息系統)上均以正名為金錢蒲acorusgramineus。金錢蒲根莖可入藥，主治痰涎壅閉、神識不清、慢性氣管炎、痢疾、腸炎等。《神農本草經》記載金錢蒲“主風寒濕痹，咳逆上氣，開心孔，補五臟，通九竅，明耳目，出音聲”。
2、石菖蒲和金錢蒲進化關系相近，但品種不同，兩者的化學成分和功效都有差異，不可混用。由于兩種藥材的外觀性狀極為相似，傳統鑒別方法受限于檢驗人員的專業知識和經驗，難以辨認，另外加工成飲片后失去性狀特征，對石菖蒲和金錢蒲的摻混樣品難以進行準確鑒別，極大影響了石菖蒲的用藥安全。
3、為保障中藥用藥安全與臨床療效，有必要開發一種準確度高、專屬性好且檢測效率高的石菖蒲和金錢蒲的鑒別方法。
技術實現思路
2、本申請的目的可以通過以下技術方案實現：
3、本申請的一個方面，提供一種引物對，所述引物對包括第一引物對和/或第二引物對；
4、所述第一引物對包括：堿基序列如seq?id?no:1所示的正向引物以及堿基序列如seq?idno:2所示的反向引物；
5、所述第二引物對包括：堿基序列如seq?id?no:3所示的正向引物以及堿基序列如seq?id?no:4所示的反向引物。
6、本申請的再一方面，提供上述技術方案所述的引物對在石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的特異性鑒別中的應用。
7、本申請的再一方面，提供一種用于特異性鑒別石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的試劑盒，其包含上述任一技術方案所述的引物對。
8、在一些實施方式中，所述的試劑盒還包括擴增試劑。
9、在一些實施方式中，所述擴增試劑包括擴增緩沖液、dntp和dna聚合酶中的一種或幾種。
10、本申請的再一方面，提供一種石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的多重pcr鑒別方法，包括以下步驟：
11、提取待測樣品的dna；
12、采用上述任一技術方案所述的引物對或者試劑盒對所述待測樣品的dna進行擴增，制備擴增產物；以及，
13、對所述擴增產物進行檢測，根據所得檢測結果實現對所述待測樣品的鑒別。
14、在一些實施方式中，所述擴增的程序包括：將擴增的反應體系在94℃～96℃預變性4min～6min，再在預設程序下循環33～35次，再在71℃～73℃延伸4min～6min；
15、所述預設程序包括：在94℃～96℃下變性20s～40s，再在61℃～63℃退火20s～40s，再在71℃～73℃延伸20s～40s。
16、在一些實施方式中，每25μl的擴增的反應體系包括：2μl～3μl的10×pcr緩沖液、1.5μl～2.5μl的dntp、0.15μl～0.25μl的taq?dna聚合酶、0.2μl～0.4μl的所述第一正向引物、0.2μl～0.4μl的所述第一反向引物、0.2μl～0.4μl的所述第二正向引物、0.2μl～0.4μl的所述第二反向引物和2μl～4μl的待測樣品的dna。
17、在一些實施方式中，在所述擴增體系中：所述第一正向引物的濃度為0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第一反向引物的濃度為0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第二正向引物的濃度為0.2μmol/l～0.4μmol/l、所述第二反向引物的濃度為0.2μmol/l～0.4μmol/l。
18、在一些實施方式中，所述的多重pcr鑒別方法中，對所述擴增產物進行檢測，根據所得檢測結果實現對所述待測樣品的鑒別，包括：
19、采用瓊脂糖凝膠電泳法對所述擴增產物進行檢測，根據所得電泳圖中344bp或/和321bp處是否出現條帶，確定所述待測樣品中是否含有石菖蒲或/和金錢蒲。
20、本申請提供了一種引物對，其包括第一引物對和/或第二引物對；第一引物對包括：堿基序列如seq?id?no:1所示的正向引物以及堿基序列如seq?id?no:2所示的反向引物；第二引物對包括：堿基序列如seq?id?no:3所示的正向引物以及堿基序列如seq?id?no:4所示的反向引物。采用該引物對對金錢蒲和石菖蒲中藥材及其水提制劑dna進行擴增，所得擴增產物能用于鑒別金錢蒲和石菖蒲中藥材及其水提制劑的物種，以及其真偽或摻偽情況，可以解決水提取物(含中藥配方顆粒)在失去形態后難以鑒別的難題。
21、本申請的鑒別方法專屬性好、結果準確度高，為金錢蒲和石菖蒲中藥材及其水提制劑的用藥安全和臨床療效提供保障。
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1.一種引物對，其特征在于，所述引物對包括第一引物對和/或第二引物對；
2.權利要求1所述的引物對在石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的特異性鑒別中的應用。
3.一種用于特異性鑒別石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的試劑盒，其特征在于，其包含權利要求1所述的引物對。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括擴增試劑。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述擴增試劑包括擴增緩沖液、dNTP和DNA聚合酶中的一種或幾種。
6.一種石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的多重PCR鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.如權利要求6所述的多重PCR鑒別方法，其特征在于，所述擴增的程序包括：將擴增的反應體系在94℃～96℃預變性4min～6min，再在預設程序下循環33～35次，再在71℃～73℃延伸4min～6min；
8.如權利要求6所述的多重PCR鑒別方法，其特征在于，每25μL的擴增的反應體系包括：2μL～3μL的10×PCR緩沖液、1.5μL～2.5μL的dNTP、0.15μL～0.25
9.如權利要求8所述的多重PCR鑒別方法，其特征在于，在所述擴增體系中：所述第一正向引物的濃度為0.2μmol/L～0.4μmol/L、所述第一反向引物的濃度為0.2μmol/L～0.4μmol/L、所述第二正向引物的濃度為0.2μmol/L～0.4μmol/L、所述第二反向引物的濃度為0.2μmol/L～0.4μmol/L。
10.如權利要求6～9中任一項所述的多重PCR鑒別方法，其特征在于，對所述擴增產物進行檢測，根據所得檢測結果實現對所述待測樣品的鑒別，包括：
...【技術特征摘要】
1.一種引物對，其特征在于，所述引物對包括第一引物對和/或第二引物對；
2.權利要求1所述的引物對在石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的特異性鑒別中的應用。
3.一種用于特異性鑒別石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的試劑盒，其特征在于，其包含權利要求1所述的引物對。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還包括擴增試劑。
5.如權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述擴增試劑包括擴增緩沖液、dntp和dna聚合酶中的一種或幾種。
6.一種石菖蒲和金錢蒲中藥材及其水提制劑的多重pcr鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.如權利要求6所述的多重pcr鑒別方法，其特征在于，所述擴增的程序包括：將擴增的反應體系在94℃～96℃預變性4min～6min，再在預設程序下循環33～35次，再在71℃～73℃延伸4min～6min；
8.如權利要求6所述的多重pcr鑒別方法，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：譚斯尹，宋葉，蘭小勇，潘禮業，鐘春琳，陳向東，孫冬梅，沈斌斌，張軍，李國衛，羅宇琴，
申請(專利權)人：廣東一方制藥有限公司，
類型：發明
國別省市：
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