【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，具體涉及一種新的高活性酪氨酸解氨酶及其應用。
技術介紹
1、對香豆酸(又名：對羥基肉桂酸)，是一種天然酚類化合物。在植物次生代謝過程中，是兒茶素、花青素等許多植物代謝產物的前體，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等藥理活性，廣泛應用于食品、醫療、保健品及化妝品等行業。
2、目前對香豆酸的生產方法有植物提取法、化學合成法和生物合成法。其中植物生長周期長，受環境影響大，對香豆酸含量低且提取成本高，導致植物提取法生產成本過高，不具有市場競爭力。通過化學合成對香豆酸的傳統方法主要是采用knoevenagel縮合反應制備對香豆酸。縮合反應所采用的原料是丙二酸與對羥基苯甲醛，然后再以嗎啉、哌啶等作為催化劑進行反應，用碳酸鈉溶液將反應混合物中的產物分離出來，最后經過酸化即得到沉淀產物，該方法對條件和動力要求高，分離純化困難，易污染環境。
3、生物合成法目前有兩種途徑生產對香豆酸：
4、途徑一：以苯丙氨酸為原料，經苯丙氨酸解氨酶催化脫氨基生成肉桂酸，再經肉桂酸4-羥化酶(c4h)催化肉桂酸生成對香豆酸。這一途徑中，c4h僅通過與內質網膜結合才能發揮作用，在大腸桿菌等原核生物中很難實現活性表達，因此該路線合成效率較低；
5、途徑二：以酪氨酸為原料，在酪氨酸解氨酶作用下催化酪氨酸直接生成對香豆酸。
6、
7、酪氨酸解氨酶(tyrosine?ammonia-lyase，tal，ec?4.3.1.23)屬于芳香族氨基酸裂解酶家族的成員，可催化l-酪氨酸脫掉氨基
技術實現思路
1、本專利技術是為了克服現有技術中的酪氨酸解氨酶催化活性不足導致的對香豆酸生產效率低下的問題，發現了一種高活性的酪氨酸解氨酶，并優化合適的反應條件，用于對香豆酸的高效生產。
2、為實現上述專利技術目的，本專利技術通過以下技術方案實現：
3、本專利技術提供了一種新的酪氨酸解氨酶，該酶來源于變色栓菌(trametesversicolor)，其氨基酸序列的genbank?no：xp_008043251.1，具體序列如seq?id?no.1所示。
4、本專利技術還提供了所述酪氨酸解氨酶的編碼基因。
5、為便于在大腸桿菌中表達，該酶編碼基因(genbank?no：xp_008043251.1)被按照大腸桿菌密碼子偏愛性被優化，優化后的序列如seq?id?no.2所示。
6、本專利技術還提供了表達所述酪氨酸解氨酶的重組載體，作為優選，所述重組載體是將所述酪氨酸解氨酶編碼基因seq?id?no.2插入到大腸桿菌表達載體中，得到可大量表達酪氨酸解氨酶tvtal的重組載體。在本專利技術中優選為pet-28a(+)載體。
7、本專利技術還提供了含有所述酪氨酸解氨酶編碼基因的重組菌，作為優選，所述重組菌是將所述酪氨酸解氨酶編碼基因通過所述重組載體導入大腸桿菌中，篩選得到表達酪氨酸解氨酶的重組菌。在本專利技術中優選為大腸桿菌bl21(de3)菌株。
8、本專利技術還提供所述的酪氨酸解氨酶酶學性質的詳細研究，作為優選，所述的酪氨酸解氨酶酶學性質的研究方法為：將上述的重組菌進行發酵培養，誘導表達，將培養后的重組菌體破壁后進行分離純化，得到酪氨酸解氨酶tvtal。
9、在此基礎上分別研究了溫度、ph等條件對酶催化活性和穩定性的影響，該酶適宜反應溫度為45～65℃，適宜反應ph為9.0～11.0。
10、本專利技術還提供所述的酪氨酸解氨酶在生產對香豆酸的應用。
11、作為優選，生產對香豆酸：將發酵得到的濕菌體，底物l-酪氨酸組成轉化體系，控制合適的反應溫度和ph，通過全細胞催化法生產對香豆酸。
12、作為優選，所述轉化體系中底物l-酪氨酸的的初始濃度為100g/l，重組大腸桿菌加菌量為4％，反應溫度范圍為45～55℃，通過流加氫氧化鈉溶液控制反應ph范圍9.0～11.0。
13、作為優選，所述轉化體系中底物l-酪氨酸的的初始濃度為100g/l，重組大腸桿菌加菌量為4％，反應溫度為45℃，通過流加氫氧化鈉溶液控制反應ph在10.5左右，經12h反應，最終對香豆酸產量為53.3g/l。
14、本專利技術的有益效果在于：
15、(1)本專利技術提供的酪氨酸解氨酶是首次在trametes屬中發現并被實驗證實，與來源于phanerochaete?chrysosporium的tal的氨基酸序列同源性為69.8％，與其它經實驗證實的酪氨酸解氨酶同源性更低，本專利技術提供的tal是一個新的酪氨酸解氨酶。
16、(2)本專利技術提供了一種來源于變色栓菌(trametes?versicolor)的酪氨酸解氨酶，通過構建高表達重組工程菌和酶學性質測定，發現該酶可高效催化l-酪氨酸脫氨生成對香豆酸，產生更高濃度對香豆酸。
17、(3)進一步將該酶應用于對香豆酸的制備，發現具有反應迅速，穩定性好等優點，克服了對香豆酸產量低的缺陷，對于工業化制備對香豆酸具有重要的應用價值。
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1.一種酪氨酸解氨酶，其特征在于，來源于變色栓菌Trametes?versicolor，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，對目的基因進行密碼子優化，優化后的DNA序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.根據權利要求1所述的一種酪氨酸解氨酶，其特征在于，該酶很高的催化效率，適宜反應溫度為45～65℃，適宜反應pH為9.0～11.0。
3.一種如權利要求1-2中任意一項所述的酪氨酸解氨酶的應用，其特征在于，所述應用為酪氨酸解氨酶催化底物L-酪氨酸發生脫氨反應生成對香豆酸。
4.根據權利要求3所述一種酪氨酸解氨酶的應用，其特征在于，所述應用方法包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述一種酪氨酸解氨酶的應用，其特征在于，所述步驟(3)：全細胞催化法生產對香豆酸方法如下：將發酵得到的濕菌體、底物L-酪氨酸組成轉化體系，反應得到對香豆酸。
6.根據權利要求5所述一種酪氨酸解氨酶的應用，其特征在于，所述轉化體系中底物L-酪氨酸的的初始濃度為100g/L，重組大腸桿菌加菌量為4％，反應溫度范圍為45～55℃，通過流加氫氧化鈉溶液控制
...【技術特征摘要】
1.一種酪氨酸解氨酶，其特征在于，來源于變色栓菌trametes?versicolor，氨基酸序列如seq?id?no.1所示，對目的基因進行密碼子優化，優化后的dna序列如seq?id?no.2所示。
2.根據權利要求1所述的一種酪氨酸解氨酶，其特征在于，該酶很高的催化效率，適宜反應溫度為45～65℃，適宜反應ph為9.0～11.0。
3.一種如權利要求1-2中任意一項所述的酪氨酸解氨酶的應用，其特征在于，所述應用為酪氨酸解氨酶催化底物l-酪氨酸發生脫氨反應生成對香豆酸。
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