【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于類器官培養(yǎng)領域，具體涉及一種成釉細胞瘤類器官培養(yǎng)方法及其應用。
技術介紹
1、成釉細胞瘤(ameloblastoma，am)是頜面部常見的良性牙源性腫瘤，對患者的生活質量和面部形態(tài)影響顯著。am的局部侵襲性強，復發(fā)率高，給治療帶來了挑戰(zhàn)。因成釉細胞瘤容易復發(fā)，患者可能需要經歷多次手術，嚴重影響生活質量。am的臨床分型囊性和實性，對治療方案的選擇起決定性作用，但不同臨床類型間的細胞異質性和發(fā)病機制尚不明確，迫切需要了解決定不同臨床亞型的關鍵細胞亞型。
2、類器官(organoid)技術是一種革命性的體外細胞培養(yǎng)方法，使人們能夠在實驗室中構建出模擬真實腫瘤結構和功能的三維細胞模型。這些類器官腫瘤球是通過在精確控制的培養(yǎng)環(huán)境中引導形成的，不僅能夠復制其對應腫瘤的微觀結構，還能夠展現出相應的生理功能，為相關疾病研究和藥物測試提供了一個高度仿真的平臺。在頜骨腫瘤研究領域，類器官技術的應用尤為重要。成釉細胞瘤是一種常見的頜骨腫瘤，具有囊性和實性兩種臨床分型。利用類器官技術構建出模擬這兩種成釉細胞瘤的3d環(huán)境可深入研究它們的異質性。這種模型不僅能夠反映腫瘤細胞的生物學特性，還能夠揭示不同臨床分型之間的差異，為個性化治療提供理論依據。
3、相較于其他腫瘤類器官，成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)面臨一些特殊的挑戰(zhàn)。首先，成釉細胞瘤的來源細胞較為罕見，獲取足量的高質量細胞樣本較為困難。其次，成釉細胞瘤的微環(huán)境復雜，需要精確模擬其生長所需的細胞因子和基質條件。此外，成釉細胞瘤的侵襲性和復發(fā)性特點，也增加了類器官模型構建的復
4、成釉細胞瘤類器官模型的構建和應用前景正在逐漸被探索。例如，通過全基因組測序揭示了braf基因突變和smo基因突變在成釉細胞瘤中的高頻出現，并且這兩種突變傾向于互斥。此外，有報道稱braf抑制劑對攜帶brafv600e突變的患者有效，但大規(guī)模的臨床研究難以開展，因此成釉細胞瘤類器官模型為探索靶向藥物治療提供了一個可靠的平臺。通過這種成釉細胞瘤的類器官模型，可以進行藥物篩選，為患者提供個性化治療方案，從而為更多患者帶來治療的可能。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于解決現有技術中成釉細胞瘤類器官培養(yǎng)中污染比例較高、培養(yǎng)成功率低及生長較緩慢的問題，提供一種成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法及其應用。本專利技術獲得的成釉細胞瘤類器官能夠外模擬成釉細胞瘤的結構和生理功能，其不僅可以研究成釉細胞瘤不同臨床分型的異質性機制，還可以為釉細胞瘤的治療提供研究對象。
2、本專利技術的目的通過下述技術方案實現：
3、一種成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
4、(1)成釉細胞瘤組織用含雙抗的pbs清洗后，將其剪碎。
5、(2)將步驟(1)剪碎的成釉細胞瘤組織用組織消化液消化，當顯微鏡下觀察到組織消化液中出現較多單個細胞即可停止消化，得到消化組織懸液。
6、所述的組織消化液優(yōu)選為由腫瘤組織消化液(biogenous，k601003)中的a液basalmedium和b液supplement?20×按照體積比20:1配制得到。
7、(3)將步驟(2)得到的消化組織懸液進行細胞過濾、離心，裂紅、離心，pbs洗滌、離心；所得細胞沉淀中加入類器官培養(yǎng)基，將細胞吹勻后置于低吸附板中進行成球培養(yǎng)。當顯微鏡下觀察到2-5個單細胞聚集成球團時，收集細胞懸液、離心，所得沉淀為初步形成的成釉細胞瘤類器官球團樣結構。
8、(4)將步驟(3)得到的成釉細胞瘤類器官球團樣結構種植到基質膠中，加入類器官培養(yǎng)基進行培養(yǎng)得到成釉細胞瘤類器官。
9、步驟(1)優(yōu)選為：在無菌操作臺中，將成釉細胞瘤組織用含雙抗的預冷pbs震蕩洗滌，再用預冷pbs震蕩洗滌洗去殘留的雙抗，使用無菌器械將成釉細胞瘤組織剪碎。其中，所述的雙抗的濃度優(yōu)選為5-10％；使用無菌器械將成釉細胞瘤組織剪碎成約1mm×1mm×1mm大小。
10、步驟(3)中，所述的離心的條件優(yōu)選為1000-1400rpm離心5-10min。
11、步驟(4)優(yōu)選為：成釉細胞瘤類器官球團樣結構用類器官培養(yǎng)基吹打混勻，取細胞懸液加入到基質膠中，充分混勻后，將混有基質膠的細胞團點入細胞板中，每孔1個液滴，體積約為40-50μl；待基質膠凝固后，加入類器官培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每2-4天換一次新鮮類器官培養(yǎng)基，至得到成釉細胞瘤類器官。
12、步驟(3)、(4)中，所述的類器官培養(yǎng)基優(yōu)選包含如下組分：基礎培養(yǎng)基，b27補充劑，n-乙酰-l-半胱氨酸，煙酰胺，人表皮生長因子，a83-01，人fgf10，人fgf2，前列腺素e2，拉格魯西布(laduviglusib)，y-27632，弗斯可林(forskolin)，重組人r-spondin-1蛋白，重組人noggin蛋白；其中，所述的基礎培養(yǎng)基優(yōu)選為dmem/f12基礎培養(yǎng)基。進一步地，所述的類器官培養(yǎng)基包含如下含量的組分：基礎培養(yǎng)基，1×b27補充劑，1-1.5mmol/l?n-乙酰-l-半胱氨酸，5-15mmol/l煙酰胺，30-70ng/ml人表皮生長因子，300-700nmol/l?a83-01，5-15ng/ml人fgf10，3-7ng/ml人fgf2，0.5-1.5μmol/l前列腺素e2，0.1-0.5μmol/lladuviglusib，5-15nmol/l?y-27632，0.5-1.5μmol/l?forskolin，2-6％(w/v)r-spondin-1，2-6％(w/v)noggin。更進一步地，所述的類器官培養(yǎng)基包含如下含量的組分：基礎培養(yǎng)基，1×b27補充劑，1.25mmol/l?n-乙酰-l-半胱氨酸，10mmol/l煙酰胺，50ng/ml人表皮生長因子，500nmol/la83-01，10ng/ml人fgf10，5ng/ml人fgf2，1μmol/l前列腺素e2，0.3μmol/lladuviglusib，10nmol/l?y-27632，1μmol/l?forskolin，4％r-spondin-1，4％noggin。再進一步的，所述的類器官培養(yǎng)基中還包含l-半胱氨酸，其含量優(yōu)選為5-15mmol/l。
13、所述的成釉細胞瘤類器官培養(yǎng)方法在制備成釉細胞瘤類器官模型中的應用。
14、相比于現有技術，本專利技術的有益效果在于：本專利技術的成釉細胞瘤類器官培養(yǎng)方法，通過增強培養(yǎng)前的組織樣本預處理步驟，優(yōu)化組織消化方法，以及通過低吸附板促進單細胞聚集，減少了污染，促進了成釉細胞瘤類器官的快速生長，顯著提升了培養(yǎng)的效率和成功率，增強了類器官的結構完整性和功能模擬能力，為成釉細胞瘤的生物學研究和藥物篩選提供了高質量的模型。本專利技術能夠以更高的效率和更好的質量，獲得可用于研究和臨床應用的成釉細胞瘤類器官。
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1.一種成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(1)為：在無菌操作臺中，將成釉細胞瘤組織用含雙抗的預冷PBS震蕩洗滌，再用預冷PBS震蕩洗滌洗去殘留的雙抗，使用無菌器械將成釉細胞瘤組織剪碎。
3.根據權利要求2所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的雙抗的濃度為5-10％。
4.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(2)中，所述的組織消化液由腫瘤組織消化液中的A液Basal?Medium和B液Supplement?20×配制得到。
5.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的離心的條件為1000-1400rpm離心5-10min。
6.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(4)為：成釉細胞瘤類器官球團樣結構用類器官培養(yǎng)基吹打混勻，取細胞懸液加入到基質膠中，充分混勻后，將混有基質膠的細胞團點入細胞板中，每孔1個液滴，體積為40-50μL；待基質膠
7.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(3)、(4)中，所述的類器官培養(yǎng)基包含如下組分：基礎培養(yǎng)基，B27補充劑，N-乙酰-l-半胱氨酸，煙酰胺，人表皮生長因子，A83-01，人FGF10，人FGF2，前列腺素E2，Laduviglusib，Y-27632，Forskolin，R-spondin-1，Noggin。
8.根據權利要求7所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的類器官培養(yǎng)基包含如下含量的組分：基礎培養(yǎng)基，1×B27補充劑，1-1.5mmol/L?N-乙酰-l-半胱氨酸，5-15mmol/L煙酰胺，30-70ng/mL人表皮生長因子，300-700nmol/L?A83-01，5-15ng/mL人FGF10，3-7ng/mL人FGF2，0.5-1.5μmol/L前列腺素E2，0.1-0.5μmol/L?Laduviglusib，5-15nmol/L?Y-27632，0.5-1.5μmol/L?Forskolin，2-6％R-spondin-1，2-6％Noggin。
9.根據權利要求7或8所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的類器官培養(yǎng)基中還包含L-半胱氨酸。
10.權利要求1-9任一項所述的成釉細胞瘤類器官培養(yǎng)方法在制備成釉細胞瘤類器官模型中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(1)為：在無菌操作臺中，將成釉細胞瘤組織用含雙抗的預冷pbs震蕩洗滌，再用預冷pbs震蕩洗滌洗去殘留的雙抗，使用無菌器械將成釉細胞瘤組織剪碎。
3.根據權利要求2所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的雙抗的濃度為5-10％。
4.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(2)中，所述的組織消化液由腫瘤組織消化液中的a液basal?medium和b液supplement?20×配制得到。
5.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：所述的離心的條件為1000-1400rpm離心5-10min。
6.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤類器官的培養(yǎng)方法，其特征在于：步驟(4)為：成釉細胞瘤類器官球團樣結構用類器官培養(yǎng)基吹打混勻，取細胞懸液加入到基質膠中，充分混勻后，將混有基質膠的細胞團點入細胞板中，每孔1個液滴，體積為40-50μl；待基質膠凝固后，加入類器官培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，每2-4天換一次新鮮類器官培養(yǎng)基，至得到成釉細胞瘤類器官。
7.根據權利要求1所述的成釉細胞瘤...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：尚政軍，竇欣宇，趙暉，馮春宇，姜二輝，
申請(專利權)人：武漢大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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