【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種粉蕉啟動(dòng)子prombu5及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的原理是將人工分離和修飾過的優(yōu)質(zhì)基因，導(dǎo)入到生物體基因組中，從而達(dá)到改造生物的目的。由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀，可遺傳的修飾改變。轉(zhuǎn)基因植物是基因組中含有外源基因的植物，有可能改變植物的某些遺傳特性，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病毒、抗蟲、抗寒、抗旱、抗?jié)场⒛望}堿及耐除草劑等作物新品種。自1996年首例轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用以來，全球轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用快速發(fā)展。
2、香蕉在中國(guó)有著極為悠久的栽培歷史，早在2000多年前我國(guó)就已經(jīng)開始種植香蕉，隨著香蕉種植產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，中國(guó)現(xiàn)在已成為世界第二大香蕉種植國(guó)。香蕉在我國(guó)主要分布于廣西、廣東、福建、云南、海南等亞熱帶、熱帶地區(qū)。香蕉是重要的熱帶水果，在世界經(jīng)濟(jì)貿(mào)易中占有重要的地位。
3、大部分栽培種香蕉是由尖苞片蕉(m.acuminata)和長(zhǎng)梗蕉(m.balbisiana)兩個(gè)野生種及其種間雜交演化而成的。根據(jù)多個(gè)性狀分類值可將香蕉栽培種分為aa、aaa、ab、aab、abb、aaaa、aaab、aabb、bb和bbb等基因組型。香牙蕉(卡文迪許香蕉，cavendish)是aaa基因組型的亞組，粉蕉(pisang?awak)是abb基因組型的亞組，屬于芭蕉屬香蕉雜交品種，與巴西蕉(musa?acuminate?l.aaagroup?cv.cavendish，bx)相比風(fēng)味和口感明顯不同，營(yíng)養(yǎng)豐富，酸甜可口，其成熟過程比巴西蕉快，在國(guó)際國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上受到普遍歡迎
4、轉(zhuǎn)基因植物的研究中，啟動(dòng)子是影響轉(zhuǎn)基因表達(dá)效率的重要因素之一，因此選擇高效率的啟動(dòng)子是高效表達(dá)外源基因的關(guān)鍵。啟動(dòng)子是一段位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)的dna序列，能活化rna聚合酶，使之與模板dna準(zhǔn)確地相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性，控制基因表達(dá)(轉(zhuǎn)錄)的起始時(shí)間和表達(dá)程度，是基因表達(dá)調(diào)控的重要元件。根據(jù)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為3類：組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組織特異型啟動(dòng)子。組成型啟動(dòng)子的調(diào)控不受外界條件的影響，不同組織器官和發(fā)育階段的基因表達(dá)沒有明顯差異，所啟動(dòng)基因的表達(dá)具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時(shí)空特異性。
5、目前廣泛應(yīng)用于植物的組成型啟動(dòng)子有煙草花葉病毒camv35s啟動(dòng)子、泛素(ubiquitin)啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白(actin)啟動(dòng)子等，camv35s啟動(dòng)子常應(yīng)用于雙子葉植物中，ubiquitin啟動(dòng)子和actin啟動(dòng)子常應(yīng)用于單子葉植物中。泛素啟動(dòng)子以其啟動(dòng)效率高、甲基化程度相對(duì)較低及遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)而成為目前研究較多的啟動(dòng)子之一。目前已有多個(gè)植物如玉米、水稻、谷子的泛素啟動(dòng)子已被克隆，玉米泛素ubi-1啟動(dòng)子已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于玉米、狗尾草、小麥和水稻等單子葉植物中，水稻泛素rubq2啟動(dòng)子在水稻和甘蔗中也得到較多應(yīng)用。
6、在轉(zhuǎn)基因植物中，經(jīng)常由于需要共表達(dá)調(diào)節(jié)同一性狀的多個(gè)轉(zhuǎn)基因而重復(fù)使用同一啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)多個(gè)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。然而，重復(fù)使用包含享有高水平序列同一性的序列的多個(gè)啟動(dòng)子可能導(dǎo)致基于同源性的基因沉默。因此，每個(gè)基因一般需要獨(dú)立的啟動(dòng)子用于基因表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因植物中則需使用多個(gè)啟動(dòng)子。
7、因此，克隆更多的能在植物中高效表達(dá)的啟動(dòng)子非常必要，能為轉(zhuǎn)基因植物的生物技術(shù)育種的發(fā)展提供更多的啟動(dòng)子選擇。另外，在轉(zhuǎn)基因植物生物技術(shù)中，使用植物自身的或者接近物種的啟動(dòng)子可能會(huì)有更高的啟動(dòng)外源基因表達(dá)的效率。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種粉蕉啟動(dòng)子prombu5及應(yīng)用。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)所設(shè)計(jì)的技術(shù)方案如下：
3、本專利技術(shù)提供了一種粉蕉啟動(dòng)子prombu5，所述啟動(dòng)子prombu5的核苷酸序列如seqid?no:1所示。
4、制備上述啟動(dòng)子prombu5的方法，該方法是啟動(dòng)子prombu5的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)pcr擴(kuò)增引物對(duì)prombu5f/r；以粉蕉基因組dna為模板，使用所設(shè)計(jì)的pcr引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，得到啟動(dòng)子prombu5。
5、進(jìn)一步地，所述引物對(duì)prombu5f/r如下：
6、正向引物prombu5f：gaggaacttagattttagtaag，
7、反向引物prombu5r：cttcgccttttcccttccttgcc。
8、本專利技術(shù)還提供了一種重組載體，所述重組載體為含有上述的啟動(dòng)子prombu5的載體。
9、進(jìn)一步地，所述載體為植物表達(dá)載體pnc-121-pro。
10、本專利技術(shù)還提供了一種含有上述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌agl1。
11、本專利技術(shù)還提供了一種上述啟動(dòng)子prombu5在調(diào)控植物基因高效表達(dá)中的應(yīng)用。
12、本專利技術(shù)還提供了一種調(diào)控植物基因高效表達(dá)的方法，所述方法是將上述的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植物的愈傷組織。
13、下述各項(xiàng)之一在培育單子葉植物新品種中的應(yīng)用，其中，它包括：
14、(1)上述的啟動(dòng)子prombu5；
15、(2)上述的重組載體；
16、(3)上述的宿主細(xì)胞。
17、進(jìn)一步地，所述單子葉植物為水稻或香蕉(優(yōu)選粉蕉)。
18、本專利技術(shù)的有益效果：
19、本專利技術(shù)從數(shù)據(jù)庫中搜索出1個(gè)粉蕉的ubiquitin基因，根據(jù)其上游2000bp以內(nèi)的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，pcr擴(kuò)增出1個(gè)ubiquitin基因的啟動(dòng)子，命名為prombu5，并構(gòu)建含有g(shù)us報(bào)告基因的植物表達(dá)載體。然后通過農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)入水稻中，轉(zhuǎn)化苗的gus染色實(shí)驗(yàn)表明該啟動(dòng)子prombu5具有強(qiáng)的啟動(dòng)效率，能在水稻中高效啟動(dòng)gus基因的表達(dá)。水稻是單子葉植物中c3作物的模式植物，啟動(dòng)子prombu5可為單子葉植物的轉(zhuǎn)基因研究提供新的高效啟動(dòng)子的選擇，應(yīng)用于更多的單子葉植物的轉(zhuǎn)基因
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種粉蕉啟動(dòng)子proMbU5，其特征在于：所述啟動(dòng)子proMbU5的核苷酸序列如SEQ?IDNO:1所示。
2.一種制備權(quán)利要求1中所述啟動(dòng)子proMbU5的方法，其特征在于，該方法是啟動(dòng)子proMbU5的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物對(duì)proMbU5F/R；以粉蕉基因組DNA為模板，使用所設(shè)計(jì)的PCR引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，得到啟動(dòng)子proMbU5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述引物對(duì)proMbU5F/R如下：
4.一種重組載體，其特征在于：所述重組載體為含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子proMbU5的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述重組載體，其特征在于：所述載體為植物表達(dá)載體pNC-121-pro。
6.一種含有權(quán)利要求4所述重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌AGL1。
7.一種權(quán)利要求1所述啟動(dòng)子proMbU5在調(diào)控植物基因高效表達(dá)中的應(yīng)用。
8.一種調(diào)控植物基因高效表達(dá)的方法，其特征在于，所述方法是將權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植物的愈傷組織。
9.
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述單子葉植物為水稻或香蕉。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種粉蕉啟動(dòng)子prombu5，其特征在于：所述啟動(dòng)子prombu5的核苷酸序列如seq?idno:1所示。
2.一種制備權(quán)利要求1中所述啟動(dòng)子prombu5的方法，其特征在于，該方法是啟動(dòng)子prombu5的核苷酸序列分別設(shè)計(jì)pcr擴(kuò)增引物對(duì)prombu5f/r；以粉蕉基因組dna為模板，使用所設(shè)計(jì)的pcr引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，得到啟動(dòng)子prombu5。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述引物對(duì)prombu5f/r如下：
4.一種重組載體，其特征在于：所述重組載體為含有權(quán)利要求1所述的啟動(dòng)子prombu5的載體。
<...【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：胡偉，李美英，霍凱森，顏彥，謝鄭楠，曾黎明，馬健翔，李超超，金仲鑫，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞研究院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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