【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及獸用生物制品培育，尤其是涉及鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法及系統(tǒng)。
技術(shù)介紹
1、鴨疫里默氏桿菌病俗稱(chēng)鴨傳染性漿膜炎，鴨疫里默氏桿菌(riemerellaanatipestifer，ra)感染病是鴨、鵝、火雞等多種禽類(lèi)的一種高致病性、接觸傳染性疾病，是嚴(yán)重危害2～7周齡雛鴨和幼齡鴨的一種細(xì)菌性傳染病。本病以10～35日齡的雛鴨發(fā)病較多，發(fā)病率最高可達(dá)90％以上，死亡率為5％～75％，是影響鴨養(yǎng)殖業(yè)的重大傳染病之一。該病廣泛存在于世界各地的養(yǎng)鴨場(chǎng)，鴨場(chǎng)一旦發(fā)生該病則很難徹底清除感染。目前該病的控制主要依靠抗生素治療，但隨著該菌對(duì)多種抗生素耐藥性的不斷增加和食品安全的需要，研制疫苗以提前預(yù)防該病的需要越來(lái)越迫切；
2、在現(xiàn)有技術(shù)中，鴨疫里默氏桿菌疫苗株的篩選通常依賴(lài)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和基本的抗體檢測(cè)，這種傳統(tǒng)方法存在以下缺點(diǎn)：
3、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高：實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，且需要大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和培養(yǎng)資源。
4、篩選效率低：缺乏高效的分子篩選技術(shù)，導(dǎo)致優(yōu)良疫苗株篩選效率不高。
5、評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)單一：評(píng)估免疫原性時(shí)，主要依賴(lài)抗體效價(jià)檢測(cè)，忽視了細(xì)胞免疫的貢獻(xiàn)，且缺乏對(duì)疫苗多維度免疫反應(yīng)的全面評(píng)估。
6、為此，提出鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法及系統(tǒng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專(zhuān)利技術(shù)的目的在于提供鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法及系統(tǒng)，在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)、免疫學(xué)
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)提供如下技術(shù)方案：鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，包括如下步驟：
3、s1、疫苗株篩選方法；
4、s1-1、病原菌分離與鑒定、采集患鴨肝臟、脾臟病變組織樣本，通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)法分離鴨疫里默氏桿菌，利用pcr擴(kuò)增技術(shù)和16s?rrna序列分析鑒定菌株的種屬，并進(jìn)一步對(duì)病原菌進(jìn)行血清分型；
5、s1-2、二價(jià)疫苗株的分子篩選、通過(guò)多位點(diǎn)序列分型與全基因組測(cè)序分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)分離的鴨疫里默氏桿菌菌株進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出具有代表性的兩種不同血清型菌株，血清型1和血清型2；
6、s1-3、體外抗原表達(dá)檢測(cè)、使用免疫印跡與酶聯(lián)免疫吸附法方法，檢測(cè)菌株的主要抗原蛋白的表達(dá)情況，篩選出表達(dá)主要保護(hù)性抗原，如omp蛋白、lps的高表達(dá)株，用于疫苗開(kāi)發(fā)；
7、s2、免疫原性評(píng)估方法；
8、s2-1、動(dòng)物模型建立、選擇健康的鴨苗，如1日齡或3周齡鴨苗，進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，分別使用不同篩選的二價(jià)滅活疫苗株進(jìn)行免疫接種，設(shè)立高劑量、中劑量、低劑量組和空白對(duì)照組；
9、s2-2、抗體效價(jià)評(píng)估、通過(guò)間接elisa定期檢測(cè)各組鴨苗免疫后血清中的抗體效價(jià)，分別檢測(cè)igg、igm水平，并繪制抗體生成曲線；
10、s2-3、細(xì)胞免疫分析、采用流式細(xì)胞術(shù)分析鴨苗免疫后外周血液中的cd4+t細(xì)胞和cd8+t細(xì)胞的比例，評(píng)估細(xì)胞免疫反應(yīng)；
11、s2-4、保護(hù)性實(shí)驗(yàn)、在免疫接種后適當(dāng)時(shí)間，如14天、28天，進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，記錄不同劑量組的鴨苗發(fā)病率和死亡率，評(píng)估疫苗株的保護(hù)效力；
12、s2-5、免疫記憶持久性評(píng)估、對(duì)各組鴨苗在免疫后不同時(shí)間，如30天、60天、90天，進(jìn)行追蹤檢測(cè)，以評(píng)估免疫記憶的持久性。
13、優(yōu)選的，所述s1、疫苗株篩選方法中采用高通量篩選技術(shù)，在原有基于多位點(diǎn)序列分型和全基因組測(cè)序的篩選方法基礎(chǔ)上，整合基因編輯篩選工具，crispr-cas9以及轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)疫苗株基因和表達(dá)水平的高精度篩選。
14、優(yōu)選的，所述crispr篩選：通過(guò)基因編輯技術(shù)，對(duì)不同疫苗株的特定基因進(jìn)行敲除、過(guò)表達(dá)，觀察對(duì)免疫原性和抗原表達(dá)的影響，篩選出能夠誘導(dǎo)高水平免疫反應(yīng)的基因型菌株。
15、優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)錄組分析：使用rna-seq技術(shù)檢測(cè)不同菌株的基因表達(dá)譜，篩選在感染過(guò)程中能夠高表達(dá)主要保護(hù)性抗原，omp、lps的菌株，確保疫苗株的抗原性強(qiáng)。
16、優(yōu)選的，所述s2-2、抗體效價(jià)評(píng)估步驟中在原有抗體效價(jià)和t細(xì)胞免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步引入細(xì)胞因子檢測(cè)和記憶細(xì)胞評(píng)估，以更全面地評(píng)估疫苗的免疫原性。
17、優(yōu)選的，所述細(xì)胞因子檢測(cè)：用多重elisa或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫后il-2、ifn-γ、tnf-α細(xì)胞因子的分泌水平，評(píng)估疫苗激發(fā)的免疫強(qiáng)度。
18、優(yōu)選的，所述記憶細(xì)胞分析：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫后形成的中央記憶t細(xì)胞和效應(yīng)記憶t細(xì)胞，預(yù)測(cè)疫苗的長(zhǎng)期保護(hù)效力。
19、優(yōu)選的，所述抗原特異性免疫分析：結(jié)合分子篩選結(jié)果，針對(duì)不同疫苗株的抗原特異性，使用抗原肽庫(kù)設(shè)計(jì)免疫反應(yīng)分析工具，模擬疫苗株在實(shí)際感染中的免疫效果；
20、抗原特異性t細(xì)胞分析：
21、針對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)抗原，omp蛋白，設(shè)計(jì)肽庫(kù)并刺激免疫鴨的t細(xì)胞，分析其免疫反應(yīng)強(qiáng)度，幫助評(píng)估疫苗的抗原效力。
22、鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估系統(tǒng)，包括數(shù)據(jù)輸入與管理：將菌株篩選、抗原表達(dá)、抗體效價(jià)、細(xì)胞免疫、攻毒實(shí)驗(yàn)多維度數(shù)據(jù)錄入系統(tǒng)，進(jìn)行統(tǒng)一管理與分析；
23、數(shù)據(jù)模型構(gòu)建：采用機(jī)器學(xué)習(xí)模型對(duì)疫苗株的篩選結(jié)果和免疫原性評(píng)估數(shù)據(jù)進(jìn)行模型訓(xùn)練，預(yù)測(cè)疫苗株的免疫保護(hù)效力，模擬疫苗接種后不同免疫反應(yīng)的時(shí)間動(dòng)態(tài)，通過(guò)數(shù)學(xué)建模評(píng)估疫苗的保護(hù)期；
24、結(jié)果輸出與優(yōu)化：系統(tǒng)根據(jù)輸入數(shù)據(jù)自動(dòng)生成各疫苗株的免疫原性分析報(bào)告，建議最佳疫苗株組合，并輸出二價(jià)疫苗的保護(hù)效力預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)；
25、實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)與反饋，構(gòu)建一個(gè)實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)與反饋系統(tǒng)，自動(dòng)記錄并分析疫苗株篩選、抗體生成、細(xì)胞免疫和攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，系統(tǒng)自動(dòng)生成優(yōu)化建議。
26、優(yōu)選的，所述實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)與反饋包括實(shí)時(shí)反饋優(yōu)化模型：
27、系統(tǒng)根據(jù)實(shí)時(shí)采集的數(shù)據(jù)，自動(dòng)調(diào)整實(shí)驗(yàn)流程和評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，例如根據(jù)抗體效價(jià)變化，自動(dòng)推薦疫苗接種劑量的調(diào)整建議；
28、疫苗保護(hù)效果的動(dòng)態(tài)評(píng)估與優(yōu)化：長(zhǎng)效保護(hù)效果的動(dòng)態(tài)建模：
29、免疫記憶與保護(hù)持久性評(píng)估：在免疫原性評(píng)估系統(tǒng)中，引入免疫記憶的動(dòng)力學(xué)模型，通過(guò)追蹤疫苗接種后的長(zhǎng)期免疫記憶細(xì)胞變化，動(dòng)態(tài)模擬保護(hù)期的長(zhǎng)短；
30、公式描述：
31、m(t)＝m0·e-λt
32、其中：m(t)為時(shí)間t時(shí)記憶t細(xì)胞的數(shù)量，m0為初始記憶t細(xì)胞數(shù)量，λ為記憶細(xì)胞衰退速率；
33、長(zhǎng)效保護(hù)效果建模公式：
34、通過(guò)細(xì)胞免疫與抗體生成的綜合模擬，預(yù)測(cè)疫苗在不同時(shí)間點(diǎn)的保護(hù)效果：
35、
36、其中：a(t)為抗體效價(jià)，m(t)為記憶t細(xì)胞本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于：所述S1、疫苗株篩選方法中采用高通量篩選技術(shù)，在原有基于多位點(diǎn)序列分型和全基因組測(cè)序的篩選方法基礎(chǔ)上，整合基因編輯篩選工具，CRISPR-Cas9以及轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)疫苗株基因和表達(dá)水平的高精度篩選。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法及系統(tǒng)，其特征在于：所述CRISPR篩選：通過(guò)基因編輯技術(shù)，對(duì)不同疫苗株的特定基因進(jìn)行敲除、過(guò)表達(dá)，觀察對(duì)免疫原性和抗原表達(dá)的影響，篩選出能夠誘導(dǎo)高水平免疫反應(yīng)的基因型菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于：所述轉(zhuǎn)錄組分析：使用RNA-seq技術(shù)檢測(cè)不同菌株的基因表達(dá)譜，篩選在感染過(guò)程中能夠高表達(dá)主要保護(hù)性抗原，OMP、LPS的菌株，確保疫苗株的抗原性強(qiáng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于：所述細(xì)胞因子檢測(cè)：用多重ELISA、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫后IL-2、IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子的分泌水平，評(píng)估疫苗激發(fā)的免疫強(qiáng)度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于：所述記憶細(xì)胞分析：采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)免疫后形成的中央記憶T細(xì)胞和效應(yīng)記憶T細(xì)胞，預(yù)測(cè)疫苗的長(zhǎng)期保護(hù)效力。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于：所述抗原特異性免疫分析：結(jié)合分子篩選結(jié)果，針對(duì)不同疫苗株的抗原特異性，使用抗原肽庫(kù)設(shè)計(jì)免疫反應(yīng)分析工具，模擬疫苗株在實(shí)際感染中的免疫效果；
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估系統(tǒng)，其特征在于：包括數(shù)據(jù)輸入與管理：將菌株篩選、抗原表達(dá)、抗體效價(jià)、細(xì)胞免疫、攻毒實(shí)驗(yàn)多維度數(shù)據(jù)錄入系統(tǒng)，進(jìn)行統(tǒng)一管理與分析；
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估系統(tǒng)，其特征在于：所述實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)與反饋包括實(shí)時(shí)反饋優(yōu)化模型：
...【技術(shù)特征摘要】
1.鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于：所述s1、疫苗株篩選方法中采用高通量篩選技術(shù)，在原有基于多位點(diǎn)序列分型和全基因組測(cè)序的篩選方法基礎(chǔ)上，整合基因編輯篩選工具，crispr-cas9以及轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)疫苗株基因和表達(dá)水平的高精度篩選。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法及系統(tǒng)，其特征在于：所述crispr篩選：通過(guò)基因編輯技術(shù)，對(duì)不同疫苗株的特定基因進(jìn)行敲除、過(guò)表達(dá)，觀察對(duì)免疫原性和抗原表達(dá)的影響，篩選出能夠誘導(dǎo)高水平免疫反應(yīng)的基因型菌株。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于：所述轉(zhuǎn)錄組分析：使用rna-seq技術(shù)檢測(cè)不同菌株的基因表達(dá)譜，篩選在感染過(guò)程中能夠高表達(dá)主要保護(hù)性抗原，omp、lps的菌株，確保疫苗株的抗原性強(qiáng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鴨疫里默氏桿菌二價(jià)滅活疫苗株篩選及免疫原性評(píng)估方法，其特征在于：所述s2-2、抗體效價(jià)評(píng)估步驟中在原有抗體效價(jià)和t細(xì)胞免疫檢測(cè)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步引入細(xì)胞因子檢測(cè)...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：郭莉莉，陳蕊，王守杰，祝寧，郭曉樂(lè)，李曉彤，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：青島博霖生物科技有限公司，
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