【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及純化包含新合成的多核苷酸的溶液的方法，特別是在多核苷酸合成(例如酶促多核苷酸合成)領域。本專利技術還涉及配置為實施所述純化方法的裝置及其試劑盒。引言多核苷酸合成越來越多地用于研究領域和藥物領域以提供治療和診斷解決方案。實例包括基因組和診斷測序、多重核酸擴增、治療性抗體開發，合成生物學或核酸擴增。多核苷酸合成能夠以化學方式或酶促方式來實現。。這兩種方式通常都是通過將液體溶液從過濾板轉移到另一過濾板上來進行的，這些過濾板本身從工作站轉移到另一工作站，以將新合成的多核苷酸與合成期間使用的固體支持物分離，并且可能與污染物分離。更具體地，在專用的第一過濾板中的固體支持物上進行多核苷酸合成。一旦完成合成步驟，將附著于固體支持物的新合成的多核苷酸從第一過濾板轉移到第二過濾板(也稱為轉移板)，以從固體支持物釋放多核苷酸。最后將包含所釋放的多核苷酸的液體溶液轉移到第三過濾板(稱為脫鹽板)，以從污染物中沉淀并純化多核苷酸。因此，本領域技術人員通常使用至少三個過濾板和同樣多的轉移步驟。雖然這種方法有效，但仍然成本高昂，因為使用了更大數量的過濾板和其他消耗品，這成本更高，耐用性更低，還會產生更多的廢物。此外，大量的轉移步驟、清潔步驟和純化步驟可能產生較少量的純化的合成多核苷酸。此外，它還增加了外部污染的風險。而且，這需要在處理過程中多次破壞真空，導致延遲和可能的材料損失。本專利技術的目的是克服前述缺點中的至少一個，并且通過提出用于純化液體溶液的新方法以進一步產生其他優點，所述方法包括直接在第一過濾板中新合成多核苷酸，消除了新合成的多核苷酸從樣本裝載到回收的轉移任
技術介紹
技術實現思路
1、本專利技術涉及純化包含多核苷酸和污染物的溶液的方法，所述溶液包含在過濾板的孔中，所述孔配備有過濾器，所述方法包括：
2、-向包含在孔中的溶液添加離液劑的步驟，以獲得混合物，
3、-孵育混合物的步驟，以便在孔中獲得沉淀物和上清液，沉淀物包含多核苷酸并且上清液包含污染物的至少一部分，
4、-對孔施加差壓以通過過濾器除去上清液的步驟，沉淀物被過濾器保留，
5、-添加低鹽洗脫液的步驟，以溶解沉淀物中的多核苷酸并將溶解在低鹽洗脫液中的多核苷酸轉移到容器中，
6、其中所述方法的所述步驟在配備有過濾器的孔中進行，
7、其中所述方法在配備有過濾器的孔中進行，并且所述方法包括在添加離液劑的步驟之前酶促合成多核苷酸的步驟，所述酶促合成多核苷酸的步驟在實施添加離液劑的步驟的孔中進行。
8、在此，并且在隨后的所有內容中，應該理解的是，過濾板意指包括多個孔的板，每個孔都配備有布置在孔底部的過濾器。
9、本專利技術提出的純化包含在溶液中的多核苷酸以及污染物的方法包括至少四個步驟，其全部在過濾板的同一孔中進行。因此，不再需要將溶液從一個過濾板轉移到另一個過濾板。通過消除這種轉移，大大降低了多核苷酸損失的風險。
10、在一個或多個實施方案中，可以在孵育的第二步驟期間攪拌混合物。任選地，通過搖動過濾板完成攪拌。
11、在過濾板的同一孔中進行酶促合成多核苷酸的步驟、添加離液劑的步驟、孵育混合物的步驟、施加差壓的步驟和添加低鹽洗脫液的步驟。因此，本專利技術的方法允許在過濾板的同一孔中進行多核苷酸的合成、純化和分離。這允許在合成后直接進行純化而不進行任何轉移。
12、在一個或多個實施方案中，酶促合成多核苷酸的步驟包括：
13、a)提供具有含游離3’-羥基的3’-末端核苷酸的引發劑的子步驟，
14、b)在延長條件下使具有游離3’-o-羥基的引發劑與3’-封閉的苷三磷酸和聚合酶接觸的子步驟，使得通過摻入3’-封閉的核苷三磷酸來延長引發劑以形成3’-封閉的延長片段
15、c)解封延長片段的子步驟，以形成具有游離3’-羥基的延長片段，和
16、d)重復子步驟b)和c)直到形成多核苷酸的子步驟，
17、e)從引發劑切割多核苷酸的子步驟。
18、應當理解，每次摻入一個核苷三磷酸以延長引發劑構成一個循環。
19、在一個或多個實施方案中，通過酶促消化、通過光照切割和/或通過化學切割執行從引發劑切割多核苷酸的子步驟。
20、在一個或多個實施方案中，通過在延長條件下接觸步驟c)中獲得的延長片段來實施重復子步驟b)和c)的子步驟d)，直到形成多核苷酸。
21、酶促多核苷酸合成的實例描述于，例如ybert等人的國際專利公開wo2015/159023中。
22、在一個或多個實施方案中，所述方法包括在孵育混合物的步驟之前添加珠的步驟，以幫助沉淀混合物。因此，可以在添加離液劑之前或同時將珠添加到溶液中。或者可以，即在加入離液劑之后，將珠添加到混合物中。在任何情況下，向同一孔中添加離液劑和珠以得到混合物。
23、在一個或多個實施方案中，當該方法包括酶促合成多核苷酸的步驟時，優選地，在合成步驟之后進行添加珠的步驟。
24、在一個或多個實施方案中，珠是玻璃珠，優選二氧化硅玻璃珠。
25、在一個或多個實施方案中，珠是空心玻璃珠，優選二氧化硅空心玻璃珠。
26、在一個或多個實施方案中，珠的直徑為9微米至13微米。
27、在一個或多個實施方案中，孔的過濾器的孔徑小于珠直徑。因此，珠不能通過所述孔的過濾器。應當理解，在本專利技術的上下文中，當該方法包括在添加離液劑的步驟之前酶促合成多核苷酸的步驟時，至少第一類型的珠，優選瓊脂糖珠可用作實施所述酶促合成的支持物；并且第二類型的珠，優選玻璃珠，可以用于沉淀根據本專利技術的混合物，這兩種類型的珠都被孔的過濾器所保留。
28、在一個或多個實施方案中，過濾器優選地具有包括0.45μm至1.2μm的孔徑。
29、在一個或多個實施方案中，過濾板優選地包括96個孔或384個孔。
30、在一個或多個實施方案中，離液劑選自由以下組成的組：異丙醇溶液、碘化鈉溶液、高氯酸鈉溶液、以及它們組合中的一種。優選地，離液劑是異丙醇溶液。
31、在一個或多個實施方案中，孵育混合物以獲得沉淀物的步驟優選地在室溫下進行，并且優選地至少孵育10分鐘。
32、在一個或多個實施方案中，通過孵育混合物在孔中形成沉淀物和上清液，上清液包含至少一部分污染物，并且沉淀物包含多核苷酸和任選地包含另一部分污染物。
33、在一個或多個實施方案中，方法包括洗滌沉淀物的步驟，以除去沉淀物中的污染物。
34、在一個或多個實施方案中，方法本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.純化包含多核苷酸和污染物的溶液的方法，所述溶液包含在過濾板的孔中，所述孔配備有過濾器，所述方法包括：
2.根據前述權利要求所述的方法，其中所述酶促合成多核苷酸的步驟包括：
3.根據權利要求2所述的方法，其中通過酶促消化、通過光照切割和/或通過化學切割實施從所述引發劑切割所述多核苷酸的子步驟。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在室溫下實施孵育步驟。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中孵育步驟進行至少10分鐘
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述過濾板優選地包括96個孔或384個孔
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述離液劑選自由以下組成的組：異丙醇溶液、碘化鈉溶液、高氯酸鈉溶液、以及它們組合中的一種。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中通過孵育所述混合物在所述孔中形成沉淀物和上清液，所述上清液包含所述污染物的至少一部分，并且所述沉淀物包含所述多核苷酸和任選地所述污染物的另一部分
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述方
10.根據前述權利要求所述的方法，其中所述洗滌溶液是乙醇溶液，優選地包含以體積計70％至80％的乙醇。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述方法包括在所述孵育混合物的步驟之前添加珠的步驟。
12.根據前述權利要求所述的方法，其中所述孔的過濾器的孔徑小于所述珠的直徑。
13.根據權利要求11或12中任一項所述的方法，其中所述珠是玻璃珠，優選地為二氧化硅玻璃珠。
14.根據前述權利要求所述的方法，其中所述珠是空心珠。
15.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述過濾器的孔徑為0.45μm至1.2μm。
16.根據權利要求11至14中任一項所述的方法，其中所述珠的直徑為9微米至13微米。
17.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述新合成的至少一種多核苷酸的長度為至少10個核苷酸長，優選地至少17個核苷酸長。
18.試劑盒，其被配置為實施根據前述權利要求中任一項所述的方法，所述試劑盒包括：
19.根據權利要求18所述的試劑盒，其中所述試劑盒還包括：
20.裝置，其被配置為實施根據權利要求1至17中任一項所述的方法。
21.根據權利要求20所述的裝置，其中所述裝置包括合成工作站和回收工作站，其中所述合成工作站包括位于壓力調節器和/或搖動器工作站上方的過濾板。
22.根據權利要求21所述的裝置，其中所述裝置還包括配置成位于所述過濾板下方的冷卻或加熱工作站。
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.純化包含多核苷酸和污染物的溶液的方法，所述溶液包含在過濾板的孔中，所述孔配備有過濾器，所述方法包括：
2.根據前述權利要求所述的方法，其中所述酶促合成多核苷酸的步驟包括：
3.根據權利要求2所述的方法，其中通過酶促消化、通過光照切割和/或通過化學切割實施從所述引發劑切割所述多核苷酸的子步驟。
4.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中在室溫下實施孵育步驟。
5.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中孵育步驟進行至少10分鐘
6.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述過濾板優選地包括96個孔或384個孔
7.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述離液劑選自由以下組成的組：異丙醇溶液、碘化鈉溶液、高氯酸鈉溶液、以及它們組合中的一種。
8.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中通過孵育所述混合物在所述孔中形成沉淀物和上清液，所述上清液包含所述污染物的至少一部分，并且所述沉淀物包含所述多核苷酸和任選地所述污染物的另一部分
9.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述方法包括：
10.根據前述權利要求所述的方法，其中所述洗滌溶液是乙醇溶液，優選地包含以體積計70％至80％的乙醇。
11.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：穆阿德·凱勒，保羅·貝林，
申請(專利權)人：DNA斯克瑞普特公司，
類型：發明
國別省市：
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