【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
技術介紹
1、已經研究了經由對寡核苷酸進行互補堿基配對來識別特定rna靶核酸序列作為用于治療多種疾病和病癥的方法。已經設計了具有不同化學修飾的單鏈與雙鏈寡核苷酸例如通過反義機制，諸如rna干擾(rnai)、間隔聚體或空間阻斷來調節基因表達。
2、兩類核苷酸間鍵聯如今在臨床上重要的寡核苷酸中占主導地位：具有帶電荷的主鏈的鍵聯，諸如磷酸二酯和硫代磷酸酯(ps)(stec等,j.am.chem.soc.106(20),1984,6077-6079)，以及中性鍵聯，諸如例如嗎啉代寡核苷酸類似物的二氨基磷酸酯鍵聯，其中核堿基的核糖用嗎啉代環(pmo)置換。pmo廣泛用作不需要rna酶h活性的空間阻斷寡核苷酸，包括例如作為剪接調節寡核苷酸。
3、間隔聚體是寡核苷酸構建體，所述寡核苷酸構建體包括支持rna酶h活性的約8-12個核苷酸的中央間隔區域以及提供穩定性并且增加對rna的親和力的約1-5個修飾的核苷酸的兩個側接區域(也稱為“翼”)。通常，間隔聚體包括沿寡核苷酸的整個長度的硫代磷酸酯(ps)鍵聯。中央間隔區域中的核苷酸通常包括硫代磷酸酯(ps)連接的dna核苷酸，并且側翼通常包括糖修飾，諸如2’-o-甲基化(2’-ome)、2’-o-甲氧基乙基(2’-moe)或連接的核酸(lna)(通過硫代磷酸酯(ps)鍵聯連接)。除支持rna酶h活性外，據信間隔區域通過與膜蛋白的動態共價相互作用促進轉染(laurent等,angew.chem.int.ed.2021,60,1-6)。據信，rna酶h活性需要間隔區域中的8或9個
4、已經研究了間隔區域中核苷酸的選擇性化學取代以提高治療指數并且降低間隔聚體寡核苷酸的毒性。因為許多蛋白質有利于結合至間隔聚體的5'翼(側翼)，所以已經發現，從間隔區域的5'端起在位置2-4的親水或中性鍵聯傾向于降低毒性。已經研究的其他設計將獨特的化學組分引入間隔聚體的側接區域，例如帶電荷的n3'-p5'或中性胍鹽(pn)鍵聯，這改善藥理學和基因沉默(kupryushkin等,phosphoryl?guanidines:a?new?type?ofnucleic?acid?analogues.acta?nat.2014,6,116-118；gryaznov等,nucleic?acids?res.,24:1508-1514,1996)。
5、還已經報道了使用中性鍵聯，例如甲基膦酸酯，但是發現其在水溶液中具有降低的溶解度，并且與螺旋的去穩定化和合成挑戰相關(guo等,phosphorus,sulfur?andsilicon?1999,第144-146卷,363-366)。
6、最近提出混合主鏈間隔聚體在不損害在中樞神經系統(cns)中的活性的情況下產生毒性較小的反義寡核苷酸(aso)。還提出了基于電荷中和磷酸三酯修飾的前藥概念(meade等,nat?biotechnol.201432(12),1256-1261)。
7、盡管含有嗎啉代和dna-ps的寡核苷酸取得了個別的成功，但合并嗎啉代與dna-ps亞基兩者的寡核苷酸雜合體的化學合成受到目前用于產生pmo的合成策略的阻礙(heera等,j.am.chem.soc.,142,38:16240(2020))。pmo通常在聚苯乙烯樹脂上以6′至3′方向制備(paul和marvin,j.am.chem.soc.,138:15663(2016))，這與天然dna/rna或大多數類似物的化學合成的標準方法不相容，后者以逐步的3′至5′方向制備。(圖1)。此外，pmo合成通常使用p(v)化學，而dna或rna合成使用p(iii)亞氨基磷酸酯化學。由于這些和其他原因，pmo和dna合成被認為是不相容的。
8、最近合成pmo-aso嵌合體的嘗試包括在主鏈中將ps帶電荷鍵聯和嗎啉代環組合的硫代氨基磷酸酯(thiophosphoroamidate)(也稱為硫代氨基磷酸酯(phosphorothioamidate))嗎啉代(tmo)-寡核苷酸。這些寡核苷酸的合成通過依序添加嗎啉代3'-二亞氨基磷酸酯p(iii)核苷酸以3'至5'方向實現(langner等,j.am.chem.soc.2020,142(38),16240-16253)。caruthers報道了一種可與人肌營養不良蛋白基因的外顯子中的靶區域特異性雜交以誘導長度為8至50個核苷酸的外顯子跳躍的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸包含硫代嗎啉代核苷酸(tmo)，所述硫代嗎啉基核苷酸包含與人肌營養不良蛋白基因外顯子中的靶區域互補的至少8至10個連續核苷酸，其中所述tmo包含嗎啉代亞基，其中所述嗎啉代亞基的嗎啉代氮通過含有硫代磷酸酯的核苷酸間鍵聯連接至相鄰核苷酸的5′環外碳或相鄰嗎啉代亞基的6′-環外碳，或tmo/dna嵌合體，其中至少一個核苷酸堿基包含除尿嘧啶以外的堿基(圖2和圖3)。
9、仍然需要一種穩健并且靈活的合成途徑來產生含有嗎啉代核苷酸和其他治療相關修飾的嵌合體，例如供在具有改善的生物屬性的新治療藥物中使用。
技術實現思路
1、本公開提供了制備雜合寡核苷酸的方法，所述方法包括在載體上以6'至3'或5'至3'方向組裝p(iii)和p(v)核苷酸，并且使用pmo?6’-亞氨基磷酸酯p(iii)或氨基磷酸酯p(v)作為來自載體的第一核苷酸。
2、本公開提供了一種通過本公開的方法合成的雜合寡核苷酸。
3、本公開還提供了一種包含以下的雜合寡核苷酸：
4、(i)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含第一5'或6’端和第一3'端，其中所述第一3'端包含末端3'核酸殘基，所述末端3核酸殘基為嗎啉代核苷酸類似物；
5、(ii)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包含第二5'端和第二3'端，其中所述第二5'端包含末端5'核酸殘基，所述末端5核酸殘基為脫氧核糖核苷酸或其類似物，或核糖核苷酸或其類似物；以及
6、(iii)至少一個硫代氨基磷酸酯鍵聯，所述至少一個硫代氨基磷酸酯鍵聯連接第一核苷酸序列的末端3'核酸殘基和第二核苷酸序列的末端5'核酸殘基。
7、本公開還提供了一種包含以下的雜合寡核苷酸：
8、(i)至少一個p(iii)嗎啉代核苷酸類似物；
9、(ii)至少一個p(v)嗎啉代核苷酸類似物；
10、(iii)至少一個p(iii)核糖核苷酸、至少一個p(iii)脫氧核糖核苷酸類似物或本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種制備雜合寡核苷酸的方法，所述方法包括在載體上以6'至3'或5'至3'方向組裝P(III)和P(V)核苷酸并且使用PMO?6’-亞氨基磷酸酯P(III)或氨基磷酸酯P(V)作為來自所述載體的第一核苷酸。
2.如權利要求1所述的方法，其中PMO?6’-亞氨基磷酸酯P(III)是來自所述載體的所述第一核苷酸。
3.如權利要求1所述的方法，其中PMO?6’-氨基磷酸酯P(V)是來自所述載體的所述第一核苷酸。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述雜合寡核苷酸包含：
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述方法包括將第一反向亞酰胺酯偶聯至嗎啉代環的仲氨基以形成硫代氨基磷酸酯鍵聯。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，所述方法還包括添加至少一個P(III)核苷酸。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，所述方法包括添加至少兩個P(III)核苷酸。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述P(III)核苷酸是連續的。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，所述方法還包括
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，所述方法包括添加至少兩個P(V)核苷酸。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述P(V)核苷酸是連續的。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中至少兩個P(III)核苷酸隨后為至少兩個P(V)核苷酸。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中至少兩個P(V)核苷酸隨后為至少兩個P(III)核苷酸。
14.如權利要求1-13中任一項所述的方法，其中至少一個P(III)核苷酸和一個P(V)核苷酸交替以形成P(III)-P(V)-P(III)或P(V)-P(III)-P(V)基序。
15.如權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述P(III)核苷酸是相同的。
16.如權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述P(III)核苷酸是不同的。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述P(V)核苷酸是相同的。
18.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述P(V)核苷酸是不同的。
19.如權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述方法包括將第一DNA單體的3'端仲氨基去保護和中和。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述方法包括進一步將一個或多個其他DNA核苷酸添加至所述第一DNA核苷酸，其中兩個或更多個DNA核苷酸經由硫代磷酸酯(PS)鍵聯連接的。
21.如權利要求19-20中任一項所述的方法，其中所述方法還包括將第二PMO?6’-亞氨基磷酸酯P(III)添加至所述雜合寡核苷酸的3'端DNA核苷酸。
22.如權利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述雜合寡核苷酸包含間隔聚體，所述間隔聚體包含：
23.如權利要求22所述的方法，其中所述方法包括通過將一個或多個其他DNA單體添加至所述第一DNA單體來延長所述寡核苷酸，所述一個或多個其他DNA單體通過硫代磷酸酯鍵(DNA-PS)連接。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述方法還包括將PMO?6’-亞氨基磷酸酯P(III)添加至所述寡核苷酸的3'端。
25.如權利要求24所述的方法，所述方法包括在所述5'側翼和所述間隔中的所有基于胞苷的核苷酸受N-苯甲酰基保護并且蓋帽A是基于異丁酸酐、特戊酸酐或苯甲酸酐而不是乙酸酐之后添加所述PMO?6’-亞氨基磷酸酯P(III)。
26.如權利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸包含：6'-PMO-DNA-PMO-3'、6'-PMO-DNA-RNA-3'、5'-RNA-DNA-PMO-3'。
27.如權利要求23-26中任一項所述的方法，其中所述3'和5'側翼的所述核苷通過亞基間鍵聯連接。
28.一種雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸通過如權利要求1-27中任一項所述的方法合成。
29.如權利要求28所述的雜合寡核苷酸，其中所述方法還包括純化所述寡核苷酸。
30.如權利要求28或29所述的雜合寡核苷酸，其中所述方法還包括分離所述寡核苷酸。
31.一種雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸包含：
32.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸包含10至50個核苷酸。
33.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸包含15至30個核苷酸。
34.如權利要求3...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種制備雜合寡核苷酸的方法，所述方法包括在載體上以6'至3'或5'至3'方向組裝p(iii)和p(v)核苷酸并且使用pmo?6’-亞氨基磷酸酯p(iii)或氨基磷酸酯p(v)作為來自所述載體的第一核苷酸。
2.如權利要求1所述的方法，其中pmo?6’-亞氨基磷酸酯p(iii)是來自所述載體的所述第一核苷酸。
3.如權利要求1所述的方法，其中pmo?6’-氨基磷酸酯p(v)是來自所述載體的所述第一核苷酸。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述雜合寡核苷酸包含：
5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述方法包括將第一反向亞酰胺酯偶聯至嗎啉代環的仲氨基以形成硫代氨基磷酸酯鍵聯。
6.如權利要求1-5中任一項所述的方法，所述方法還包括添加至少一個p(iii)核苷酸。
7.如權利要求1-6中任一項所述的方法，所述方法包括添加至少兩個p(iii)核苷酸。
8.如權利要求7所述的方法，其中所述p(iii)核苷酸是連續的。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，所述方法還包括添加至少一個p(v)核苷酸。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，所述方法包括添加至少兩個p(v)核苷酸。
11.如權利要求10所述的方法，其中所述p(v)核苷酸是連續的。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，其中至少兩個p(iii)核苷酸隨后為至少兩個p(v)核苷酸。
13.如權利要求1-12中任一項所述的方法，其中至少兩個p(v)核苷酸隨后為至少兩個p(iii)核苷酸。
14.如權利要求1-13中任一項所述的方法，其中至少一個p(iii)核苷酸和一個p(v)核苷酸交替以形成p(iii)-p(v)-p(iii)或p(v)-p(iii)-p(v)基序。
15.如權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述p(iii)核苷酸是相同的。
16.如權利要求1-14中任一項所述的方法，其中所述p(iii)核苷酸是不同的。
17.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述p(v)核苷酸是相同的。
18.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述p(v)核苷酸是不同的。
19.如權利要求1-18中任一項所述的方法，其中所述方法包括將第一dna單體的3'端仲氨基去保護和中和。
20.如權利要求19所述的方法，其中所述方法包括進一步將一個或多個其他dna核苷酸添加至所述第一dna核苷酸，其中兩個或更多個dna核苷酸經由硫代磷酸酯(ps)鍵聯連接的。
21.如權利要求19-20中任一項所述的方法，其中所述方法還包括將第二pmo?6’-亞氨基磷酸酯p(iii)添加至所述雜合寡核苷酸的3'端dna核苷酸。
22.如權利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述雜合寡核苷酸包含間隔聚體，所述間隔聚體包含：
23.如權利要求22所述的方法，其中所述方法包括通過將一個或多個其他dna單體添加至所述第一dna單體來延長所述寡核苷酸，所述一個或多個其他dna單體通過硫代磷酸酯鍵(dna-ps)連接。
24.如權利要求23所述的方法，其中所述方法還包括將pmo?6’-亞氨基磷酸酯p(iii)添加至所述寡核苷酸的3'端。
25.如權利要求24所述的方法，所述方法包括在所述5'側翼和所述間隔中的所有基于胞苷的核苷酸受n-苯甲酰基保護并且蓋帽a是基于異丁酸酐、特戊酸酐或苯甲酸酐而不是乙酸酐之后添加所述pmo?6’-亞氨基磷酸酯p(iii)。
26.如權利要求23所述的方法，其中所述寡核苷酸包含：6'-pmo-dna-pmo-3'、6'-pmo-dna-rna-3'、5'-rna-dna-pmo-3'。
27.如權利要求23-26中任一項所述的方法，其中所述3'和5'側翼的所述核苷通過亞基間鍵聯連接。
28.一種雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸通過如權利要求1-27中任一項所述的方法合成。
29.如權利要求28所述的雜合寡核苷酸，其中所述方法還包括純化所述寡核苷酸。
30.如權利要求28或29所述的雜合寡核苷酸，其中所述方法還包括分離所述寡核苷酸。
31.一種雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸包含：
32.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸包含10至50個核苷酸。
33.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸包含15至30個核苷酸。
34.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸包含20至30個核苷酸。
35.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述第一核苷酸序列包含兩個或更多個嗎啉代核苷酸類似物。
36.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述第一核酸序列的所述末端3'核酸殘基是p(iii)嗎啉代核苷酸類似物。
37.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述第一核酸序列的所述末端3'核酸殘基是p(v)嗎啉代核苷酸類似物。
38.如權利要求35所述的雜合寡核苷酸，其中所述兩個或更多個嗎啉代寡核苷酸類似物通過二氨基磷酸酯鍵聯連接。
39.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述第一核苷酸序列還包含一個或多個核苷酸殘基，所述一個或多個核苷酸殘基包含脫氧核糖核苷酸或其類似物或核糖核苷酸或其類似物或它們的組合。
40.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述第二核苷酸序列包含兩個或更多個脫氧核糖核苷酸類似物、兩個或更多個核糖核苷酸類似物或它們的組合。
41.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述脫氧核糖核苷酸類似物或核糖核苷酸類似物選自：p(iii)dna類似物、反向p(iiii)dna類似物、p(iii)rna類似物、反向p(iii)rna類似物或它們的組合。
42.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，所述雜合寡核苷酸包含選自以下的2’修飾的核糖核苷酸類似物：2'-o-甲基(2'-ome)p(iii)rna、反向2'-o-甲基(2'-ome)p(iii)rna、2'-o-甲氧基乙基(2'-omoe)p(iii)rna、反向2'-o-甲氧基乙基(2'-moe)p(iii)rna、2'-氟p(iii)rna、反向2'-氟p(iii)rna或它們的組合。
43.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述兩個或更多個脫氧核糖核苷酸或類似物、兩個或更多個核糖核苷酸或其類似物或它們的組合各自通過核苷酸間鍵聯連接。
44.如權利要求43所述的雜合寡核苷酸，其中所述核苷酸間鍵聯是硫代磷酸酯、磷酸二酯或二氨基磷酸酯鍵聯。
45.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述第二核苷酸序列還包含一個或多個pmo。
46.如權利要求31所述的雜合寡核苷酸，其中所述p(iii)pmo選自：p(iii)pmo-c、p(iii)pmo-g、p(iii...
【專利技術屬性】
技術研發人員：伊雷紐什·諾瓦克，錢自清，馬赫布貝·海拉瓦迪，
申請(專利權)人：恩特拉達治療學股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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