【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本專利技術涉及在無細胞蛋白質合成系中通過一鍋法反應制造核糖體大亞基和/或核糖體小亞基的方法。
技術介紹
1、核糖體是讀取mrna的基因信息而合成蛋白質的分子復合體。核糖體由小亞基（ssu：small?subunit）和大亞基（lsu：large?subunit）形成，例如，大腸桿菌的70s核糖體由以21種蛋白和1種rna（16s?rrna）構成的30s亞基（ssu）、以及以33種蛋白和2種rna（23srrna和5s?rrna）構成的50s亞基（lsu）形成。
2、如果能夠通過在核糖體的構成要素中導入突變來改變核糖體的催化活性，則可期待蛋白質的翻譯效率的提高、包含非天然氨基酸的非天然蛋白質的高效合成、包含酯鍵、硫酯鍵、糖苷鍵等的非天然聚合物的高效合成等的實現。然而，核糖體是生命的必須因子，向核糖體導入突變在大部分情況下與細胞死亡直接相關，因此制作包含導入了突變的核糖體的細胞是極其困難的。因此，以往開發了在體外重構核糖體的技術。
3、例如，非專利文獻1中報告了：在體外，在從70s核糖體分離的全部核糖體蛋白（r-蛋白）的存在下，進行核糖體rna（rrna）的轉錄，由此能夠利用轉錄的rrna和r-蛋白重構核糖體。在該方法中，存在容易向rrna導入突變，但無法向r-蛋白導入突變的缺點。
4、另外，非專利文獻2中報告了：在體外，在20種ssu?r-蛋白的存在下，通過同時進行16s?rrna的轉錄和1種ssu?r-蛋白的轉錄及翻譯，能夠重構ssu。該方法必須表達、純化20種ssu?r-蛋白來準備，因此存在
5、現有技術文獻
6、非專利文獻
7、非專利文獻1：michael?c?jewett?et?al.，in?vitro?integration?of?ribosomalrna?synthesis，ribosome?assembly，and?translation（核糖體rna合成、核糖體組裝和翻譯的體外整合），mol?syst?biol.2013?jun25；9:678.doi:?10.1038/msb.2013.31.
8、非專利文獻2：shimojo，m.et?al.?in?vitro?reconstitution?of?functionalsmall?ribosomal?subunit?assembly?for?comprehensive?analysis?of?ribosomalelements?in?e.coli.（用于大腸桿菌核糖體元件的綜合分析的功能性核糖體小亞基組裝的體外重構）commun?biol?3,142（2020）.
技術實現思路
1、專利技術要解決的技術問題
2、本專利技術的一個目的在于提供一種在無細胞蛋白質合成系中通過一鍋法反應制造核糖體lsu、核糖體ssu或核糖體的方法。
3、用于解決技術問題的技術方案
4、本專利技術人等為了確立通過無細胞蛋白質合成系的一鍋法反應制造核糖體lsu的技術而進行了深入研究，結果發現：在包括在無細胞蛋白質合成系中組裝lsu?r-蛋白和lsurrna而形成核糖體lsu的工序的核糖體lsu的制造方法中，通過在該無細胞蛋白質合成系中使lsu?r-蛋白中的至少1個由模板核酸生成，能夠利用一鍋法反應簡易地制造核糖體lsu。
5、另外，本專利技術人等為了確立通過無細胞蛋白質合成系的一鍋法反應制造核糖體ssu的技術而進行了深入研究，結果發現：在包括在無細胞蛋白質合成系中組裝ssu?r-蛋白和ssu?rrna而形成核糖體ssu的工序的核糖體ssu的制造方法中，通過在該無細胞蛋白質合成系中使ssu?r-蛋白中的至少2個由模板核酸生成，能夠利用一鍋法反應簡易地制造核糖體ssu。
6、進而，本專利技術人等為了確立通過無細胞蛋白質合成系的一鍋法反應制造核糖體的技術而進行了深入研究，結果發現：在包括通過在無細胞蛋白質合成系中進行lsu?r-蛋白與lsu?rrna的組裝以及ssu?r-蛋白與ssu?rrna的組裝而形成核糖體的工序的核糖體的制造方法中，通過在該無細胞蛋白質合成系中使lsu?r-蛋白和ssu?r-蛋白中的至少1種由模板核酸生成，能夠利用一鍋法反應簡易地制造核糖體。
7、另外，在r-蛋白的模板核酸中能夠通過慣用方法容易地導入突變，因此在使用r-蛋白的模板核酸作為起始材料的上述方法中，通過對模板核酸施加突變，能夠簡便地制造導入了突變的核糖體ssu和/或lsu。本專利技術是基于這些見解進一步反復研究而完成的。
8、本專利技術的一實施方式中，提供下述揭示的核糖體lsu的制造方法和使用該核糖體lsu的聚合物的制造方法。
9、項1-1.?一種核糖體lsu的制造方法，其為在無細胞蛋白質合成系中制造核糖體lsu的方法，所述制造方法包括：在無細胞蛋白質合成系中，組裝lsu?r-蛋白和lsu?rrna，形成核糖體lsu的工序，
10、在所述無細胞蛋白質合成系中，使所述lsu?r-蛋白中的至少1個由編碼lsu?r-蛋白的模板核酸生成。
11、項1-2.?根據項1-1所述的制造方法，其中，使所述lsu?rrna中的至少1個由在所述無細胞蛋白質合成系中編碼lsu?rrna的模板dna生成。
12、項1-3.?根據項1-1或1-2所述的制造方法，其中，所述核糖體lsu源自大腸桿菌。
13、項1-4.?根據項1-3所述的制造方法，其中，構成所述核糖體lsu的核糖體大亞基蛋白不包含50s?r-蛋白l11，而包含32個以下的50s?r-蛋白。
14、項1-5.?根據項1-1～1-4中任一項所述的制造方法，其中，對所述lsu?rrna實施賦予耐藥性的突變。
15、項1-6.?根據項1-5所述的制造方法，其中，所述核糖體lsu源自大腸桿菌，對23srrna實施了a2058u的突變。
16、項1-7.?根據項1-1～1-6中任一項所述的制造方法，其中，在所述無細胞蛋白質合成系中，使待組裝的lsu?r-蛋白全部由編碼lsu?r-蛋白的模板核酸生成。
17、項1-8.?根據項1-1～1-7中任一項所述的制造方法，其中，在所述無細胞蛋白質合成系中，編碼lsu?r-蛋白的模板核酸的濃度分別為1fm～1 μm。 本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種核糖體大亞基的制造方法，其特征在于，在無細胞蛋白質合成系中制造核糖體大亞基，所述制造方法包括以下工序：
2.根據權利要求1所述的制造方法，其中，使所述核糖體大亞基RNA中的至少1個由在所述無細胞蛋白質合成系中編碼核糖體大亞基RNA的模板DNA生成。
3.根據權利要求1或2所述的制造方法，其中，所述核糖體大亞基源自大腸桿菌。
4.根據權利要求3所述的制造方法，其中，構成所述核糖體大亞基的核糖體大亞基蛋白不包含50S?r-蛋白L11，而包含32個以下的50S?r-蛋白。
5.根據權利要求1或2所述的制造方法，其中，對所述核糖體大亞基RNA實施賦予耐藥性的突變。
6.根據權利要求1或2所述的制造方法，其中，在所述無細胞蛋白質合成系中，使待組裝的核糖體大亞基蛋白全部由編碼核糖體大亞基蛋白的模板核酸生成。
7.一種在無細胞合成系中制造聚合物的方法，其特征在于，包括以下工序：
8.一種核糖體小亞基的制造方法，其特征在于，在無細胞蛋白質合成系中制造核糖體小亞基，所述制造方法包括以下工序：
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10.根據權利要求8或9所述的制造方法，其中，所述核糖體小亞基源自大腸桿菌。
11.根據權利要求8或9所述的制造方法，其中，所述核糖體小亞基RNA的反SD序列被設定為能夠識別在所述無細胞蛋白質合成系的翻譯中使用的核糖體的核糖體小亞基RNA的反SD序列不識別的SD序列。
12.根據權利要求8或9所述的制造方法，其中，對所述核糖體小亞基RNA和所述核糖體小亞基蛋白中的至少1種實施賦予耐藥性的突變。
13.根據權利要求8或9所述的制造方法，其中，在所述無細胞蛋白質合成系中，使待組裝的核糖體小亞基蛋白全部由編碼核糖體小亞基蛋白的模板核酸生成。
14.一種在無細胞合成系中制造聚合物的方法，其特征在于，包括以下工序：
15.一種核糖體的制造方法，其特征在于，在無細胞蛋白質合成系中制造核糖體，所述制造方法包括以下工序：
16.根據權利要求15所述的制造方法，其中，所述核糖體源自大腸桿菌。
17.根據權利要求15或16所述的制造方法，其中，在所述無細胞蛋白質合成系中，使待組裝的核糖體大亞基蛋白全部由編碼核糖體大亞基蛋白的模板核酸生成。
18.根據權利要求15或16所述的制造方法，其中，在所述無細胞蛋白質合成系中，使待組裝的核糖體小亞基蛋白全部由編碼核糖體小亞基蛋白的模板核酸生成。
19.根據權利要求15或16所述的制造方法，其中，在所述無細胞蛋白質合成系中，使核糖體大亞基RNA和核糖體小亞基RNA中的至少1個由編碼該RNA的模板DNA生成。
20.一種在無細胞合成系中制造聚合物的方法，其特征在于，包括以下工序：
...【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種核糖體大亞基的制造方法，其特征在于，在無細胞蛋白質合成系中制造核糖體大亞基，所述制造方法包括以下工序：
2.根據權利要求1所述的制造方法，其中，使所述核糖體大亞基rna中的至少1個由在所述無細胞蛋白質合成系中編碼核糖體大亞基rna的模板dna生成。
3.根據權利要求1或2所述的制造方法，其中，所述核糖體大亞基源自大腸桿菌。
4.根據權利要求3所述的制造方法，其中，構成所述核糖體大亞基的核糖體大亞基蛋白不包含50s?r-蛋白l11，而包含32個以下的50s?r-蛋白。
5.根據權利要求1或2所述的制造方法，其中，對所述核糖體大亞基rna實施賦予耐藥性的突變。
6.根據權利要求1或2所述的制造方法，其中，在所述無細胞蛋白質合成系中，使待組裝的核糖體大亞基蛋白全部由編碼核糖體大亞基蛋白的模板核酸生成。
7.一種在無細胞合成系中制造聚合物的方法，其特征在于，包括以下工序：
8.一種核糖體小亞基的制造方法，其特征在于，在無細胞蛋白質合成系中制造核糖體小亞基，所述制造方法包括以下工序：
9.根據權利要求8所述的核糖體小亞基的制造方法，其中，使所述核糖體小亞基rna由在所述無細胞蛋白質合成系中編碼核糖體小亞基rna的模板dna生成。
10.根據權利要求8或9所述的制造方法，其中，所述核糖體小亞基源自大腸桿菌。
11.根據權利要求8或9所述的制造方法，其中，所述核...
【專利技術屬性】
技術研發人員：青木航，小坂唯心，
申請(專利權)人：國立大學法人大阪大學，
類型：發明
國別省市：
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