【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，具體涉及一種磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、限制性內(nèi)切酶是一類識(shí)別特定位點(diǎn)并在識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)或附近切割雙鏈dna的脫氧核糖核酸酶，常用于dna分子的克隆與構(gòu)建。傳統(tǒng)的分子克隆需要經(jīng)過繁瑣的操作步驟來實(shí)現(xiàn)新載體的構(gòu)建。具體操作步驟如圖1所示。傳統(tǒng)的分子克隆技術(shù)主要是通過酶切-連接手段實(shí)現(xiàn)的。其中質(zhì)粒酶切后，需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并對(duì)質(zhì)粒線性化條帶進(jìn)行切膠回收，獲得酶切產(chǎn)物，大約耗時(shí)120min。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、現(xiàn)有技術(shù)中質(zhì)粒酶切后進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程步驟繁瑣，耗時(shí)；其中膠回收酶切產(chǎn)物片段傳統(tǒng)方法是用苯酚/氯仿提取，然后再乙醇沉淀片段，此方法不僅操作步驟繁瑣，且回收片段時(shí)有部分質(zhì)量損失，導(dǎo)致回收率較低，且殘留的苯酚會(huì)影響下游實(shí)驗(yàn)。最終會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成功率不高，給科研人員帶來不便。
2、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本專利技術(shù)提供一種磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
3、第一方面，本專利技術(shù)提供一種磁珠，所述磁珠表面修飾有限制性內(nèi)切酶和羥基。
4、優(yōu)選地，所述限制性內(nèi)切酶為bamhi和hindiii中的一種或兩種，
5、優(yōu)選地，所述限制性內(nèi)切酶為bamhi和hindiii，
6、優(yōu)選地，磁珠表面修飾的bamhi和磁珠表面修飾的hindiii的酶活比值為1:3-3:1，優(yōu)選為1:1；
7、優(yōu)選地，所述磁珠的粒徑為500nm-1μm。
8、第二方面，本專利技術(shù)提供所述的磁珠的制備方法，
9、優(yōu)選地，所述活化劑為氯丙基三甲氧基硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷中的一種或兩種以上的組合，優(yōu)選地，所述活化劑為氯丙基三乙氧基硅烷；
10、和/或，按ul/u計(jì)，所述活化劑與限制性內(nèi)切酶的比例為1：2-10；
11、和/或，活化修飾的反應(yīng)溫度為20-30℃；
12、和/或，活化修飾的反應(yīng)時(shí)間為0.5-2h。
13、優(yōu)選地，所述活化修飾的限制性內(nèi)切酶與納米四氧化三鐵在ph值為8-9的反應(yīng)液中進(jìn)行反應(yīng)；
14、優(yōu)選地，所述反應(yīng)液為tris反應(yīng)液；
15、優(yōu)選地，反應(yīng)溫度為0-8℃；
16、優(yōu)選地，反應(yīng)時(shí)間為20-30h。
17、優(yōu)選地，所述限制性內(nèi)切酶為bamhi和hindiii中的一種或兩種，優(yōu)選地，所述限制性內(nèi)切酶為bamhi和hindiii；
18、和/或，按u/mg計(jì)，活化修飾的限制性內(nèi)切酶與磁珠的比例為1-4:1；
19、優(yōu)選地，按u/mg計(jì)，活化修飾的bamhi與磁珠的比例為1-3:1；
20、優(yōu)選地，按u/mg計(jì)，活化修飾的hindiii與磁珠的比例為1-3:1。
21、第三方面，本專利技術(shù)提供所述的制備方法得到的磁珠。
22、第四方面，本專利技術(shù)提供一種試劑盒，所述試劑盒中含有所述的磁珠或所述的制備方法得到的磁珠。
23、優(yōu)選地，所述試劑盒中含有磁珠酶切體系預(yù)混液，酶切產(chǎn)物結(jié)合液，漂洗液和洗脫液；
24、其中，所述磁珠酶切體系預(yù)混液中含有所述磁珠。
25、優(yōu)選地，所述磁珠酶切體系預(yù)混液中含有tris-acetate、山梨醇和所述磁珠；
26、優(yōu)選地，所述磁珠酶切體系預(yù)混液中tris-acetate的濃度為15-30mm，優(yōu)選為20mm，優(yōu)選地，tris-acetate的ph值為7.5-8.5，優(yōu)選地，tris-acetate的ph值為7.9；
27、優(yōu)選地，所述磁珠酶切體系預(yù)混液中山梨醇的濃度為60-80wt％，優(yōu)選為70wt％，
28、優(yōu)選地，所述磁珠酶切體系預(yù)混液中磁珠的濃度為0.5-2wt％，優(yōu)選為1wt％；
29、優(yōu)選地，所述磁珠酶切體系預(yù)混液還含有醋酸鎂、醋酸鉀和bsa；
30、更優(yōu)選地，所述磁珠酶切體系預(yù)混液中醋酸鎂的濃度為5-15mm，優(yōu)選為10mm；
31、更優(yōu)選地，所述磁珠酶切體系預(yù)混液中醋酸鉀的濃度為40-60mm，優(yōu)選為50mm；
32、更優(yōu)選地，所述磁珠酶切體系預(yù)混液中bsa的濃度為5-15μg/ml，優(yōu)選為10μg/ml；
33、和/或，所述酶切產(chǎn)物結(jié)合液中含有醇和鹽；
34、優(yōu)選地，所述酶切產(chǎn)物結(jié)合液中醇的體積百分比為75-85％，優(yōu)選為80％；
35、優(yōu)選地，所述醇為異丙醇，所述鹽為乙酸銨；
36、更優(yōu)選地，所述酶切產(chǎn)物結(jié)合液中含有1-2m鹽乙酸銨，優(yōu)選為1.5m鹽乙酸銨；
37、優(yōu)選地，所述酶切產(chǎn)物結(jié)合液的ph值為5-6，優(yōu)選為5.5。
38、第五方面，本專利技術(shù)提供所述的磁珠或所述的制備方法得到的磁珠或所述的試劑盒在質(zhì)粒酶切回收中的應(yīng)用。
39、本專利技術(shù)具有如下有益效果：
40、1、本專利技術(shù)提供的磁珠表面同時(shí)修飾有限制性內(nèi)切酶和核酸結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)用于質(zhì)粒酶切-回收一體化試劑盒中能夠?qū)崿F(xiàn)質(zhì)粒酶切和提取一體化。
41、2、本專利技術(shù)解決了質(zhì)粒酶切回收步驟繁瑣，耗時(shí)長的問題。利用本專利技術(shù)提供的試劑盒，從酶切到回收獲得酶切產(chǎn)物僅需要3個(gè)步驟，共耗時(shí)20min。與傳統(tǒng)的質(zhì)粒酶切-回收相比，不需要進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳切膠回收，利用磁珠的吸附能力直接回收酶切產(chǎn)物，回收效率顯著提高50％。
42、3、所述試劑盒能夠用在核酸提取儀(hr-z-ii)同一程序中完成質(zhì)粒酶切和酶切產(chǎn)物回收。
43、4、質(zhì)粒酶切提取一體化試劑盒中的成分包括磁珠酶切體系預(yù)混液，酶切產(chǎn)物結(jié)合液，漂洗液和洗脫液。其中磁珠酶切體系預(yù)混液中的酶切提取磁珠表面同時(shí)修飾有限制性內(nèi)切酶和羥基，限制性內(nèi)切酶可以進(jìn)行質(zhì)粒酶切，酶切后羥基位點(diǎn)可以結(jié)合酶切產(chǎn)物。
44、5、磁珠酶切體系預(yù)混液含有本專利技術(shù)提供的能夠進(jìn)行酶切提取的磁珠和山梨醇溶液。山梨醇溶液具有吸濕性，使預(yù)混液在低溫下不會(huì)結(jié)晶，磁珠表面結(jié)構(gòu)和偶聯(lián)的限制性內(nèi)切酶不會(huì)受到破壞，能夠長期保存在低溫條件下保證酶切提取磁珠的酶切活性穩(wěn)定。
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1.一種磁珠，其特征在于，所述磁珠表面修飾有限制性內(nèi)切酶和羥基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁珠，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶為BamHI和HindIII中的一種或兩種，
3.權(quán)利要求1或2所述的磁珠的制備方法，其特征在于，所述磁珠的制備方法包括如下步驟，利用活化劑活化修飾限制性內(nèi)切酶，然后在堿性環(huán)境中使活化修飾的限制性內(nèi)切酶與納米四氧化三鐵進(jìn)行反應(yīng)，得到表面修飾有限制性內(nèi)切酶和羥基的磁珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述活化劑為氯丙基三甲氧基硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷中的一種或兩種以上的組合，優(yōu)選地，所述活化劑為氯丙基三乙氧基硅烷；
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，所述活化修飾的限制性內(nèi)切酶與納米四氧化三鐵在pH值為8-9的反應(yīng)液中進(jìn)行反應(yīng)；
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶為BamHI和HindIII中的一種或兩種，優(yōu)選地，所述限制性內(nèi)切酶為BamHI和HindIII；
7.權(quán)利要求3-6任意一項(xiàng)所述的制備方法得到的磁珠。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種磁珠，其特征在于，所述磁珠表面修飾有限制性內(nèi)切酶和羥基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的磁珠，其特征在于，所述限制性內(nèi)切酶為bamhi和hindiii中的一種或兩種，
3.權(quán)利要求1或2所述的磁珠的制備方法，其特征在于，所述磁珠的制備方法包括如下步驟，利用活化劑活化修飾限制性內(nèi)切酶，然后在堿性環(huán)境中使活化修飾的限制性內(nèi)切酶與納米四氧化三鐵進(jìn)行反應(yīng)，得到表面修飾有限制性內(nèi)切酶和羥基的磁珠。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述活化劑為氯丙基三甲氧基硅烷、氯丙基三乙氧基硅烷中的一種或兩種以上的組合，優(yōu)選地，所述活化劑為氯丙基三乙氧基硅烷；
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于，所述活化修飾的...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：肖曉文，馬夢(mèng)婷，喻春函，杜軍，宋輝，曹文剛，葉岸勇，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：湖北擎科生物科技有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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