【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于藥物篩選，具體涉及一種利用斑馬魚睡眠覺醒頻次篩選促進睡眠藥物的方法。
技術介紹
1、睡眠障礙已經成為威脅人類健康的巨大隱患，目前，針對睡眠障礙的藥物療法多采用鎮靜催眠等藥物，但常伴隨記憶力下降、依賴性等諸多副作用，因此，尋找副作用小、療效好的調節睡眠藥物仍然是當前臨床迫切需要解決的問題。
2、由于體外細胞模型無法真實模擬機體復雜的睡眠行為，目前用于睡眠藥物篩選研究的模型主要為大鼠和小鼠，但鼠類晝伏夜出習性，在模擬人類自然睡眠節律上存在一定的局限性，且在藥物大規模篩選上存在周期長、成本高等問題，因此開發高通量、低成本篩選體系顯得尤為必要。斑馬魚被美國nih列為繼大小鼠之后第三大模式脊椎動物，且具有產卵量高、實驗周期短、成本低等優點，是非常優良的藥物高通量篩選模型；前期研究證實斑馬魚與人類睡眠表現基本一致，斑馬魚與人類一樣具有非常規律的晝夜節律現象，尤其在慢波睡眠和傳播波睡眠(類似快速眼動睡眠)階段(nature，2019)二者基本一致，斑馬魚是睡眠相關藥物篩選良好的替代模型。
3、目前，基于細胞水平的篩選技術無法模擬真實睡眠狀態，基于哺乳類整體動物模型的篩選方法存在周期長、費用高等問題。因此，需要尋找一種能夠模擬真實睡眠狀態且藥物篩選周期短、成本低的藥物篩選動物模型。
技術實現思路
1、本專利技術旨在克服現有影響睡眠行為藥物篩選過程中存在的周期長、成本高、通量低等問題，提供一種利用斑馬魚睡眠或覺醒頻次篩選改善睡眠藥物的方法，以實現藥物的高通量、低
2、本專利技術第一方面的目的，在于提供一種篩選改善睡眠藥物的方法。
3、本專利技術第二方面的目的，在于提供本專利技術第一方面的方法在藥品或食品的改善睡眠功效評價中的應用。
4、為了實現上述目的，本專利技術所采取的技術方案是：
5、本專利技術的第一個方面，提供一種篩選改善睡眠藥物的方法，包括以下步驟：以斑馬魚為模型生物，以斑馬魚睡眠和/或覺醒頻次作為評價指標，篩選可促進睡眠的藥物。
6、斑馬魚作為一種國際通用脊椎模式動物，易于實現高通量、低成本的藥物篩選，是對當前睡眠相關藥物研發體系的重要補充，且更符合國際實驗動物福利倫理“3r原則”(減少、替代和優化)。
7、在本專利技術一些實施方式中，將斑馬魚分為空白對照組、陽性藥物對照組、受試物組，按照分組處理斑馬魚，利用斑馬魚行為軌跡跟蹤設備對各組斑馬魚晝夜睡眠行為進行記錄；利用r語言統計分析將各組斑馬魚的晝夜睡眠行為轉換成單位分鐘內睡眠或覺醒頻次，并對各組斑馬魚的睡眠和覺醒頻次進行差異顯著性分析。
8、在本專利技術一些實施方式中，所述斑馬魚行為軌跡跟蹤設備包括斑馬魚行為學分析系統。
9、在本專利技術一些實施方式中，藥物的效果判定如下：在實驗有效的前提下，對于睡眠頻次，當受試物組平均覺醒頻次大于空白對照組且與其相比有顯著性差異，則判定該受試物具有改善睡眠效果，反之無改善睡眠效果；對于覺醒頻次，當受試物組平均覺醒頻次需小于空白對照組且與其相比有顯著性差異，則判定受試物具有改善睡眠效果，反之無改善睡眠效果。
10、在本專利技術一些實施方式中，所述實驗有效的判定如下：對于睡眠頻次，陽性藥對照組平均覺醒頻次需大于空白對照組且與空白對照組相比有顯著性差異，判定此次試驗結果有效；對于覺醒頻次，陽性藥對照組平均覺醒頻次小于空白對照組且與空白對照組相比有顯著性差異，判定此次試驗結果有效。
11、在本專利技術一些實施方式中，所述空白對照組為使用胚胎培養液處理斑馬魚。
12、在本專利技術一些實施方式中，所述胚胎培養液包括nacl、kcl、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o和nahco3。
13、在本專利技術一些實施方式中，各處理組的處理過程為：將斑馬魚置于含胚胎培養液、陽性藥物溶液或受試物溶液的孔板中，靜置20～48h，期間不投喂、不換液。
14、在本專利技術一些實施方式中，所述方法中各處理組處理過程中的光照強度為200～300lux，溫度為27～30℃，光/暗周期為14/10h。
15、在本專利技術一些實施方式中，所述斑馬魚為5～6日齡斑馬魚仔魚。此時的斑馬魚仔魚活動量正常，且適應性好。
16、斑馬魚擁有與哺乳類高度相似的基礎生物結構和生理功能，與人類疾病相關基因同源率高達82％，尤其在睡眠節律上，與小鼠晝伏夜出習性相比，斑馬魚睡眠節律與人類更為接近，在睡眠評價研究上，相對于小鼠實驗的30～45天，斑馬魚評價時間可縮短至24h；同時由于斑馬魚具備飼養成本低、發育周期短、單次產卵次數高等特點，能同時進行多個供試品的評價，相比小鼠更經濟。
17、在本專利技術一些實施方式中，所述方法中還可設置助溶劑對照組，所述助溶劑包括有助于陽性藥物或受試物溶液的試劑。
18、本專利技術的第二個方面，提供本專利技術第一方面的方法在藥品或食品的改善睡眠功效評價中的應用。
19、本專利技術的有益效果是：
20、本專利技術利用斑馬魚睡眠或覺醒頻次篩選改善睡眠藥物的方法特別適合用于改善睡眠藥物的快速篩選。所使用的斑馬魚是國際通用脊椎模式動物，背景清晰、易于獲取、質量穩定可控，實驗結果可信度高、重復性好，便于大規模推廣應用。
21、本專利技術方法可利用96孔板同時對96尾5～6日齡斑馬魚睡眠行為進行大規模監測，且在24～48h內可完成篩選評價，與傳統哺乳動物模型相比，本專利技術方法篩選效率獲得較大提升，且篩選成本獲得大幅度下降，是對當前藥物篩選體系的重要補充。
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1.一種篩選改善睡眠藥物的方法，包括以下步驟：以斑馬魚為模型生物，以斑馬魚睡眠和/或覺醒頻次作為評價指標，篩選可促進睡眠的藥物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括：將斑馬魚分為空白對照組、陽性藥物對照組、受試物組，按照分組處理斑馬魚，利用斑馬魚行為軌跡跟蹤設備對各組斑馬魚晝夜睡眠行為進行記錄；利用R語言統計分析將各組斑馬魚的晝夜睡眠行為轉換成單位分鐘內睡眠或覺醒頻次，并對各組斑馬魚的睡眠和覺醒頻次進行差異顯著性分析。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，藥物的效果判定如下：在實驗有效的前提下，對于睡眠頻次，當受試物組平均覺醒頻次大于空白對照組且與其相比有顯著性差異，則判定該受試物具有改善睡眠效果，反之無改善睡眠效果；對于覺醒頻次，當受試物組平均覺醒頻次需小于空白對照組且與其相比有顯著性差異，則判定受試物具有改善睡眠效果，反之無改善睡眠效果。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述實驗有效的判定如下：對于睡眠頻次，陽性藥物對照組平均覺醒頻次需大于空白對照組且與空白對照組相比有顯著性差異，判定此次試驗結果有效
5.根據權利要求1～4中任一項所述的方法，其特征在于，所述空白對照組為使用胚胎培養液處理斑馬魚。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，各處理組的處理過程為：將斑馬魚置于含胚胎培養液、陽性藥物溶液或受試物溶液的孔板中，靜置20～48h，期間不投喂、不換液。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法中各處理組處理過程中的光照強度為200～300lux，溫度為27～30℃，光/暗周期為14/10h。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述斑馬魚為5～6日齡斑馬魚仔魚。
9.根據權利要求1～4中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法中還可設置助溶劑對照組，所述助溶劑包括有助于陽性藥物或受試物溶解的試劑。
10.權利要求1～9中任一項所述的方法在藥品或食品的改善睡眠功效評價中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種篩選改善睡眠藥物的方法，包括以下步驟：以斑馬魚為模型生物，以斑馬魚睡眠和/或覺醒頻次作為評價指標，篩選可促進睡眠的藥物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括：將斑馬魚分為空白對照組、陽性藥物對照組、受試物組，按照分組處理斑馬魚，利用斑馬魚行為軌跡跟蹤設備對各組斑馬魚晝夜睡眠行為進行記錄；利用r語言統計分析將各組斑馬魚的晝夜睡眠行為轉換成單位分鐘內睡眠或覺醒頻次，并對各組斑馬魚的睡眠和覺醒頻次進行差異顯著性分析。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，藥物的效果判定如下：在實驗有效的前提下，對于睡眠頻次，當受試物組平均覺醒頻次大于空白對照組且與其相比有顯著性差異，則判定該受試物具有改善睡眠效果，反之無改善睡眠效果；對于覺醒頻次，當受試物組平均覺醒頻次需小于空白對照組且與其相比有顯著性差異，則判定受試物具有改善睡眠效果，反之無改善睡眠效果。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述實驗有效的判定如下：對于睡眠頻次，陽性藥物對照組平均覺醒頻次需大于空白對照組...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔡磊，魏遠征，苗宗余，葉惠欣，吳美慧，張鈺，
申請(專利權)人：廣東省實驗動物監測所，
類型：發明
國別省市：
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