【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥領域，具體涉及一種體外光驅動類囊體膜再生輔酶nadh的方法。
技術介紹
1、nadh(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，還原型)，作為生物氧化還原酶的重要輔因子之一，在生物體內的多種代謝反應中起到關鍵作用。氧化還原酶是酶學分類的六大酶類中最大的一類酶，因其催化過程中具有良好的特異性和選擇性，在醫藥生產、工業制造、高值化學品合成等領域被廣泛應用。目前，已知的以nadh為輔因子的氧化還原酶約占所有氧化還原酶的80％(chem.rev.2011,111,4111-4140.)，在還原羰基、羧酸、c＝c雙鍵、硝基和c-n多鍵的過程中起到至關重要作用(chem,2017,2,621-654.)。例如，氧化還原酶中的醇脫氫酶adh能將各種羰基化合物(包括芳香酮、脂肪酮、酮酯類和鹵代酮類等)催化還原成具有光學活性的醇類(org.biomol.chem.2010,8,1540-1550.)，醫藥生產上利用nadh依耐型醇脫氫酶將3,5-二(三氟甲基)苯乙酮(btap)高效還原合成止吐藥阿瑞匹坦的重要手性中間體(j.mol.catal.b:enzym.2004,28,25-32.)，日本izumori等人利用阿拉伯糖醇脫氫酶(nadh依耐型)催化阿拉伯糖醇產生l-木酮糖(j.ferment.bioeng.1991,72,488-490.)。然而，nadh價格昂貴，有效的再生方法至關重要，輔因子再生不僅可以大大降低反應成本，還可以提高反應效率，同時避免了輔因子復雜的制備分離提取過程，因此，nadh的再生也成為許多工業和研究應用中的關鍵技術
技術實現思路
1、為了改善上述技術問題，本專利技術提供一種體外光驅動類囊體膜再生nadh的方法，包括：
2、(1)類囊體膜的分離提取；
3、(2)鐵氧還蛋白(fdx,ferredoxin)和ferredoxin:nad+還原酶(mafnr)的表達純化；
4、(3)將類囊體膜耦聯mafnr并與fdx在一個反應體系中混合進行光驅動類囊體膜再生nadh反應。
5、在一個實施方案中，前述類囊體膜為菠菜來源的類囊體膜；
6、優選的，所述fdx為菠菜來源的fdx，所述mafnr為marinomonas?mediterranea來源的ferredoxin:nad+還原酶。
7、在一個實施方案中，前述步驟(3)的反應體系中還加入有hepes緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、磷酸氫根、adp、甜菜堿、類囊體膜、抗壞血酸鈉和輔因子。
8、在一個實施方案中，所述hepes緩沖液的ph為7.6；
9、優選地，所述hepes緩沖液的濃度為50mm。
10、在一個實施方案中，所述鎂鹽為氯化鎂或硫酸鎂；
11、優選地，所述鎂鹽為氯化鎂；
12、更優選地，所述鎂鹽的濃度為5mm。
13、在一個實施方案中，所述鉀鹽為氯化鉀或硫酸鉀，
14、優選地，鉀鹽為氯化鉀；
15、更優選地，所述鉀鹽的濃度為10mm。
16、在一個實施方案中，所述磷酸氫根鹽為磷酸氫二鉀或磷酸氫二鈉等，
17、優選地，所述磷酸氫根鹽為磷酸氫二鉀；
18、更優選地，所述磷酸氫根鹽的濃度為10mm。
19、在一個實施方案中，所述輔因子為nad+；
20、優選地，所述nad+輔因子的濃度為1～10mm。
21、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應的溫度為30℃。
22、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應的光照強度為50～100μmol?photons?m-2s-1。
23、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應的時間為0、10、20、30、40、50分鐘。
24、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應中adp的濃度為3～30mm。
25、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應中抗壞血酸鈉的用量為1～10mm。
26、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應中甜菜堿的用量為0.1～0.5m。
27、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應中fdx的用量為5～10μm。
28、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應中類囊體膜的用量為10～20μg葉綠素當量/ml。
29、在一個實施方案中，所述光驅動類囊體膜再生nadh中mafnr的用量為0～4μm。
30、有益效果
31、本專利技術涉及利用體外光驅動類囊體膜再生n本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種體外光驅動類囊體膜再生NADH的方法，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，所述類囊體膜為菠菜來源的類囊體膜；
3.根據權利要求1或2所述的方法，所述步驟(3)的反應體系中還加入有HEPES緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、磷酸氫根、ADP、甜菜堿、類囊體膜、抗壞血酸鈉和輔因子。
4.根據權利要求3所述的方法，所述輔因子為NAD+；
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，所述光驅動類囊體膜再生NADH反應的溫度為30℃。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，所述光驅動類囊體膜再生NADH反應的光照強度為50～100μmol?photons?m-2s-1。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，所述光驅動類囊體膜再生NADH反應中甜菜堿的用量為0.1～0.5M。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，所述光驅動類囊體膜再生NADH反應中Fdx的用量為5～10μM。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的方法，所述光驅動類囊體膜再生NADH反應中類囊體膜的用量為10～20μg葉綠
10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，所述光驅動類囊體膜再生NADH中MaFNR的用量為0～4μM。
...【技術特征摘要】
1.一種體外光驅動類囊體膜再生nadh的方法，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，所述類囊體膜為菠菜來源的類囊體膜；
3.根據權利要求1或2所述的方法，所述步驟(3)的反應體系中還加入有hepes緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、磷酸氫根、adp、甜菜堿、類囊體膜、抗壞血酸鈉和輔因子。
4.根據權利要求3所述的方法，所述輔因子為nad+；
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應的溫度為30℃。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，所述光驅動類囊體膜再生nadh反應的光...
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱之光，李飛，
申請(專利權)人：中國科學院天津工業生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：
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