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    一種小鼠氣道類器官模型的構建方法技術

    技術編號:44479888 閱讀:4 留言:0更新日期:2025-03-04 17:47
    本發明專利技術公開了一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,涉及動物模型技術領域,其技術要點為:本發明專利技術通過提取小鼠氣道上皮細胞,并建立早產和足月新生小鼠氣道類器官的穩定傳代,同時使用形態學檢查、免疫熒光、定量實時PCR、轉錄組測序和蛋白質微陣列分析等方法檢測足月及早產小鼠氣道類器官的特點,及其對呼吸道合胞病毒(RSV)感染的反應差異情況,為研究呼吸系統疾病和氣道發育提供了優秀的體外模型。

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及動物模型,具體涉及一種小鼠氣道類器官模型的構建方法


    技術介紹

    1、由于圍產期醫療條件的改善,早產兒的數量一直在增加,約占全球新生兒的11%。盡管如此,存活的早產兒通常面臨相當大的呼吸挑戰,包括支氣管肺發育不良、感染后癥狀加劇、住院率和持續時間增加,以及對生長和發展的負面影響。早產打亂了呼吸系統發育的自然進程,導致持續到兒童期的不利呼吸結果。盡管導致這些不利呼吸結果的基本機制尚未完全理解,氣道上皮內的固有異常可能在其中起了一定作用。

    2、近期關于氣管上皮的研究主要集中在疾病和感染模型上,而只有少數研究檢查了氣道上皮的發育。關于早產兒與足月兒氣道中的功能性細胞(包括杯狀細胞和俱樂部細胞)的差異以及與早產兒對呼吸系統疾病的易感性的關聯,目前尚無共識。然而,分泌細胞失衡與許多疾病有關,包括肺炎、氣道阻塞和進行性間質性肺病,這可能與未成熟氣道的脆弱性的根本原因有關。

    3、為了揭示早產氣道的差異和潛在機制,實驗模型從20世紀90年代的死亡嬰兒的尸檢樣本發展到現代動物模型,如小鼠、大鼠、綿羊和猴子。然而,90年代的尸檢樣本與當代嬰兒的差異顯著,并且它們的可用性有限。通過支氣管鏡活組織檢查從新生兒中獲取人類樣本由于倫理問題而具有挑戰性。像綿羊和猴子這樣的大型動物需要高育種成本和延長的培養時間。直接使用小動物,如早產小鼠,一旦與母親分離,很難維持生存,這使得在實驗干預后跟蹤連續的身體變化變得不可能。

    4、為此,本專利技術旨在提供一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,以解決上述問題。


    技術實現思路

    1、本專利技術的目的是為了解決上述問題,提供一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,通過改進培養條件提高了小鼠氣道類器官的存活率和狀態,為早產和足月小鼠的氣道發育及呼吸系統疾病研究提供了一個可靠的體外模型,有助于深入理解新生兒氣道的發育差異和免疫反應機制。

    2、為了達到上述目的,本專利技術的技術方案如下:

    3、本專利技術提供了一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,所述方法包含以下步驟:

    4、s1、小鼠氣道樣本準備:將小鼠在無特定病原體(specific?pathogen?free,spf)環境中飼養,當小鼠中的母鼠妊娠達到16.5天時,對母鼠進行剖腹產;取出小鼠幼崽,并記錄小鼠幼崽的體重和長度,將小鼠幼崽麻醉后解剖小鼠幼崽的氣道組織,為小鼠氣道樣本;

    5、s2、樣本組織處理和氣道類器官培養:將小鼠氣道樣本用冷dpbs沖洗兩次后,浸泡在消化液中,在37℃的搖床上消化1小時,通過實驗室用吸頭吹打細胞懸浮液并過濾,將過濾后的溶液放入離心機中離心3分鐘,結束取細胞沉淀物,并將細胞沉淀物用addf+++洗滌兩次,并嵌入matrigel基質膠中;

    6、在孔板的單個孔中播種含有基質膠和氣道細胞的懸浮液,在37℃下固化15分鐘后,向每個孔中加入氣道類器官培養基,并在標準培養條件下孵化,當氣道類器官直徑達到100-200μm時,對小鼠氣道類器官進行傳代,完成氣道類器官培養;

    7、s3、統計分析:每個實驗至少重復三次。所有數據表示為平均值±sd。所有統計分析都使用graphpadprism軟件(版本9)進行。進行正態性測試以確定所有統計數據是否符合正態分布。使用t檢驗比較兩組之間的差異。對于兩組或更多組之間的比較,使用單因素方差分析(anova)后跟dunnett的多重比較測試。當數據不呈正態分布時,使用mann-whitney-wilcoxon測試代替t檢驗比較組之間的差異。對于三組或更多組之間的比較,使用單因素方差分析(anova)進行統計比較。組之間的顯著差異用*p<0.05表示(統計顯著性水平設定為p<0.05)。

    8、所述氣道類器官培養基包括addf+++、1×b27、5mm煙酰胺、1.25mm?n-乙酰半胱氨酸、500ng/ml?r-spondin1、25ng/ml重組人fgf7、100ng/ml重組人fgf10、100ng/ml重組人noggin、5μmy27632、500nm?sb202190和500nma-8301;每4天或當氣道類器官培養基變黃時更換氣道類器官培養基。所述消化液由400u/ml膠原酶i、0.25mg/ml蛋白酶e、10μmy27632和10u/ml?dnase?i組成。

    9、與現有技術相比,本方案的有益效果:

    10、1.本專利技術通過小鼠模擬的未成熟氣道能夠長期培養并保持其功能,且適用于病原體干預研究,尤其是在rsv感染的研究中顯示出較好的應用前景,為研究早產兒呼吸系統疾病提供更多的研究平臺,可以用于氣道發育動態監測、病原體反應及藥物篩選等;

    11、2.本專利技術通過改進培養條件提高了小鼠氣道類器官的存活率和狀態,為早產和足月小鼠的氣道發育及呼吸系統疾病研究提供了一個可靠的體外模型,有助于深入理解新生兒氣道的發育差異和免疫反應機制。

    本文檔來自技高網
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    【技術保護點】

    1.一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,其特征是:所述方法包含以下步驟:

    2.如權利要求1所述的一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,其特征是:所述氣道類器官培養基包括AdDF+++、1×B27、5mM煙酰胺、1.25mM?N-乙酰半胱氨酸、500ng/mL?R-Spondin1、25ng/mL重組人FGF7、100ng/mL重組人FGF10、100ng/mL重組人Noggin、5μMY27632、500nM?SB202190和500nMA-8301;

    3.如權利要求1所述的一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,其特征是:所述消化液由400U/mL膠原酶I、0.25mg/mL蛋白酶E、10μMY27632和10U/ml?DNAse?I組成。

    【技術特征摘要】

    1.一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,其特征是:所述方法包含以下步驟:

    2.如權利要求1所述的一種小鼠氣道類器官模型的構建方法,其特征是:所述氣道類器官培養基包括addf+++、1×b27、5mm煙酰胺、1.25mm?n-乙酰半胱氨酸、500ng/ml?r-spondin1、25ng/ml重組人fgf7、100ng/m...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:劉洋劉瀚旻李英納楊文豪謝亮石芳楊凡
    申請(專利權)人:四川大學華西第二醫院
    類型:發明
    國別省市:

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