【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物催化，具體涉及負載納米鈀的大腸桿菌在催化芳香族醛加氫反應中的應用。
技術介紹
1、催化劑作為化學工業的基石，在現代燃料工業和化學工業的生產中具有重要地位，80％以上采用催化過程。acs在20世紀90年代提出了“綠色化學”概念，十二條原則中多條提到了產品與工藝的安全性以及使用催化劑，表明了催化劑的重要地位以及制備過程安全綠色的重要性。在催化領域，許多金屬催化劑及其氧化物表現出特殊的性能，因為它們能夠在化學反應中提供空軌道或電子，從而產生中間產物，降低反應活化能，使后續反應更加容易。生物催化又稱生物轉化，是利用有機體或者酶分子對前體化合物進行化學修飾及改造以獲得有機化合物的過程，本質上是利用酶來作為催化劑。而金屬-酶級聯催化結合了化學催化劑的廣泛反應性與生物催化劑的高選擇性，通過在同一反應體系中依次使用金屬和酶催化，實現多步反應，這種方法不僅提高了反應效率，還能避免中間產物的分離純化，簡化了工藝流程，是不對稱合成高附加值手性化合物的有效途徑。
2、細胞中的酶催化反應雖然能達到金屬催化劑無法相比的選擇性水平，但酶的底物范圍可能非常小，如果反應所需的目標化合物不是在細胞中自然產生的，則可能沒有一種天然存在的酶能夠催化所需的反應，因此，利用外源催化劑在自然界中的細胞中進行反應是一個值得探索的領域。過渡金屬在細胞內的合成與酶級聯催化能夠顯著簡化工藝流程，減少分離純化的需求，不僅降低了生產過程中的能耗，還提升了整體的經濟效益和可持續性。
3、生物法不僅在金屬催化活性提升中具有一定的潛力，并且制備過程綠
技術實現思路
1、本專利技術的目的是為了提供負載納米鈀的大腸桿菌在催化芳香族醛加氫反應中的應用。
2、本專利技術提供一種負載納米鈀的大腸桿菌在催化芳香族醛加氫反應中的應用，負載納米鈀的功能大腸桿菌的獲得方法：將重組大腸桿菌經過鈀液孵育后，使用甲酸鹽作為酶底物在微厭氧條件下進行反應獲得負載納米鈀的功能大腸桿菌；所述重組大腸桿菌在原始大腸桿菌的基礎上敲除了編碼[nife]氫化酶1和[nife]氫化酶2催化亞基的基因任意一個或兩個。
3、進一步地限定，所述鈀液為na2pdcl4水溶液或k2pdcl4水溶液；所述鈀液的濃度為0.5-1.5mm，孵育溫度為20-50℃，時間20-30min，ph為3.5-6；所述水溶性甲酸鹽為hcoona水溶液或hcook水溶液；反應體系中甲酸鹽濃度為5-25mm，反應時間為24-72h。
4、進一步地限定，所述鈀液的濃度為1mm，孵育溫度為37℃，時間25min，ph為3.5；所述水溶性甲酸鹽為hcoona水溶液或hcook水溶液；反應體系中甲酸鹽濃度為25mm，反應時間為24h。
5、進一步地限定，其特征在于，芳香族醛為苯甲醛。
6、本專利技術提供一種全細胞催化芳香族醛加氫的方法，將負載納米鈀的大腸桿菌加入到芳香族醛的溶液中反應后獲得芳香族醇。
7、進一步地限定，反應的條件為室溫，水相，一個大氣壓，攪拌反應5小時。
8、進一步地限定，負載納米鈀的功能大腸桿菌的獲得方法：將重組大腸桿菌經過鈀液孵育后，使用甲酸鹽作為酶底物在微厭氧條件下進行反應獲得負載納米鈀的功能大腸桿菌；所述重組大腸桿菌在原始大腸桿菌的基礎上敲除了編碼[nife]氫化酶1和[nife]氫化酶2催化亞基的基因；編碼[nife]氫化酶1催化亞基的基因的序列如seq?id?no.1所示；和[nife]氫化酶2催化亞基的基因的序列如seq?id?no.2所示。
9、進一步地限定，所述鈀液為na2pdcl4水溶液或k2pdcl4水溶液；所述鈀液的濃度為0.5-1.5mm，孵育溫度為20-50℃，時間20-30min，ph為3.5-6；所述水溶性甲酸鹽為hcoona水溶液或hcook水溶液；反應體系中甲酸鹽濃度為5-25mm，反應時間為24-72h。
10、進一步地限定，納米鈀的負載量為0.009-0.045mmol。
11、進一步地限定，納米鈀的大小為5.99±1.72nm，納米鈀是零價。
12、有益效果：本專利技術以大腸桿菌mc4100為出發菌株，使用帶有目的基因同源臂的kan片段轉化大腸桿菌，利用同源重組技術敲除大腸桿菌基因組上的基因hyab和hybc，成功構建基因工程菌mc4100(δhyab、δhybc)，使其無法表達[nife]氫化酶1和[nife]氫化酶2，為納米鈀的合成位置奠定實驗基礎。該菌可吸附鈀離子和通過甲酸鈉為電子供體還原鈀離子形成黑色的生物鈀納米顆粒。在生物量0.4-0.5g/l、甲酸鈉濃度為5-25mm、鈀離子濃度低于2mm、溫度20-50℃和ph?2.2-7的條件范圍內均可實現。采用透射電鏡(tem)、掃描電鏡(sem)、x射線光電子能譜(xps)表征產物，表明大腸桿菌能吸附并還原鈀離子在胞內形成納米顆粒。相較于目前關于鈀的合成案例，本專利技術使用溫和氫源代替了傳統危險氫源，且經過菌株改造實現了納米鈀的胞內定向合成。本方法預期在金屬納米顆粒制備、環境修復、生物醫學和化學工業中有較大的應用潛力。本專利構建胞內負載納米鈀的功能大腸桿菌，以苯甲醛加氫為模板反應來驗證其催化能力，預期為胞內金屬-酶級聯催化的實現提供一定的支撐作用。
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1.負載納米鈀的大腸桿菌在催化芳香族醛加氫反應中的應用，其特征在于，負載納米鈀的功能大腸桿菌的獲得方法：將重組大腸桿菌經過鈀液孵育后，使用甲酸鹽作為酶底物在微厭氧條件下進行反應獲得負載納米鈀的功能大腸桿菌；所述重組大腸桿菌在原始大腸桿菌的基礎上敲除了編碼[NiFe]氫化酶1和[NiFe]氫化酶2催化亞基的基因任意一個或兩個。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述鈀液為Na2PdCl4水溶液或K2PdCl4水溶液；所述鈀液的濃度為0.5-1.5mM，孵育溫度為20-50℃，時間20-30min，pH為3.5-6；所述水溶性甲酸鹽為HCOONa水溶液或HCOOK水溶液；反應體系中甲酸鹽濃度為5-25mM，反應時間為24-72h。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述鈀液的濃度為1mM，孵育溫度為37℃，時間25min，pH為3.5；所述水溶性甲酸鹽為HCOONa水溶液或HCOOK水溶液；反應體系中甲酸鹽濃度為25mM，反應時間為24h。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于芳香族醛為苯甲醛。
5.一種全細胞催化芳
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，反應的條件為室溫，水相，一個大氣壓，攪拌反應5小時。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，負載納米鈀的功能大腸桿菌的獲得方法：將重組大腸桿菌經過鈀液孵育后，使用甲酸鹽作為酶底物在微厭氧條件下進行反應獲得負載納米鈀的功能大腸桿菌；所述重組大腸桿菌在原始大腸桿菌的基礎上敲除了編碼[NiFe]氫化酶1和[NiFe]氫化酶2催化亞基的基因；編碼[NiFe]氫化酶1催化亞基的基因的序列如SEQ?ID?NO.1所示；和[NiFe]氫化酶2催化亞基的基因的序列如SEQ?ID?NO.2所示。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述鈀液為Na2PdCl4水溶液或K2PdCl4水溶液；所述鈀液的濃度為0.5-1.5mM，孵育溫度為20-50℃，時間20-30min，pH為3.5-6；所述水溶性甲酸鹽為HCOONa水溶液或HCOOK水溶液；反應體系中甲酸鹽濃度為5-25mM，反應時間為24-72h。
9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，納米鈀的負載量為0.009-0.045mmol。
10.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，納米鈀的大小為5.99±1.72nm，納米鈀是零價。
...【技術特征摘要】
1.負載納米鈀的大腸桿菌在催化芳香族醛加氫反應中的應用，其特征在于，負載納米鈀的功能大腸桿菌的獲得方法：將重組大腸桿菌經過鈀液孵育后，使用甲酸鹽作為酶底物在微厭氧條件下進行反應獲得負載納米鈀的功能大腸桿菌；所述重組大腸桿菌在原始大腸桿菌的基礎上敲除了編碼[nife]氫化酶1和[nife]氫化酶2催化亞基的基因任意一個或兩個。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述鈀液為na2pdcl4水溶液或k2pdcl4水溶液；所述鈀液的濃度為0.5-1.5mm，孵育溫度為20-50℃，時間20-30min，ph為3.5-6；所述水溶性甲酸鹽為hcoona水溶液或hcook水溶液；反應體系中甲酸鹽濃度為5-25mm，反應時間為24-72h。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述鈀液的濃度為1mm，孵育溫度為37℃，時間25min，ph為3.5；所述水溶性甲酸鹽為hcoona水溶液或hcook水溶液；反應體系中甲酸鹽濃度為25mm，反應時間為24h。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于芳香族醛為苯甲醛。
5.一種全細胞催化芳香族醛加氫的方法，其特征在于，將負載納米鈀的大腸桿菌加入到芳香族醛的溶液中反應后獲得芳香族醇。
【專利技術屬性】
技術研發人員：晉苗苗，咸漠，徐超，劉宇，
申請(專利權)人：中國科學院青島生物能源與過程研究所，
類型：發明
國別省市：
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