【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程及微生物發酵領域，具體地說，涉及腺苷生產菌株及其構建方法與應用。
技術介紹
1、核苷是一類糖苷的總稱。核苷是核酸和核苷酸的組成成分。核苷是由d-核糖或d-z-脫氧核糖與嘧啶堿或嘌呤堿縮合而成。核苷一般為無色結晶，不溶于普通有機溶劑，易溶于熱水，熔點為160～240℃。由d-核糖生成的核苷稱核糖核苷，參與rna組成，由d-α-脫氧核糖生成的核苷稱脫氧核糖核苷，參與dna組成。d-核糖與腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶縮合生成相應的腺嘌呤核糖核苷、鳥嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它們分別簡稱為腺苷(a)、鳥苷(g)、胞苷(c)、胸苷(t)和尿苷(u)。
2、鳥嘌呤核苷(鳥苷)和次黃嘌呤核苷(肌苷)在食品和醫藥行業有著廣泛的作用。在食品領域，鳥苷和肌苷分別是鳥苷酸二鈉和肌苷酸二鈉的重要前體，而鳥苷酸二鈉與肌苷酸二鈉組合使用作為食品增鮮劑，廣泛應用于雞精、醬油等調味品中。在醫藥領域，鳥苷和肌苷可以作為多種抗病毒藥物的醫藥中間體，如無環鳥苷、三氮唑核苷、三磷酸鳥苷鈉等都需要鳥苷作為合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前體，而肌苷酸可以作為合成腺苷酸(amp)和鳥苷酸(gmp)的前體，適用于各種原因引起的白細胞減少癥、血小板減少癥、各種心臟疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外還可治療中心視網膜炎、視神經萎縮等。
3、腺苷即腺嘌呤核苷，化學名為6-氨基-9-β-d-呋喃核糖基-9-氫嘌呤，它是腺嘌呤核苷酸脫磷酸后的產物，屬于重要的核苷酸衍生物。腺苷是一種遍布人體細
4、目前，微生物發酵是生產核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌或短小芽孢桿菌等。在生長菌株的選育與改造過程中，通過使用紫外誘變、硫酸二乙酯誘變育種，定向選育核苷高產菌株；或者根據細菌中核苷酸的代謝路徑和調節機理，深入了解菌株遺傳背景及菌株特性，通過代謝工程手段，有目的性地對菌株進行改造，以獲得性狀優良、能夠高產核苷的生產菌株。但目前核苷菌種的發酵性能仍較差、核苷的轉化率仍較低，不能滿足大規模工業化生產的需求。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種腺苷生產菌株及其構建方法與應用。
2、為了實現本專利技術目的，第一方面，本專利技術提供一種修飾的微生物，所述微生物相比于未修飾的微生物，其udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的活性增強，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的腺苷生產能力。
3、本專利技術中，所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶在ncbi上的參考序列編號為np_389401.1。
4、進一步地，微生物中的udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的活性增強是由選自以下1)-3)，或任選的組合實現的：
5、1)通過改變所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因的啟動子而增強；
6、2)通過改變所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的氨基酸序列而增強；
7、3)通過改變編碼所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的核苷酸序列而增強。
8、進一步地，可以采用誘變、定點突變或同源重組等方法來增強所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因的表達。
9、在本專利技術的具體實施方式中，udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶活性增強是通過如下a或b來實現的：
10、a、將所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因與p43啟動子可操作地連接；
11、b、將所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的第252位氨基酸突變為纈氨酸之外的其他氨基酸(優選由纈氨酸突變為異亮氨酸或亮氨酸)。
12、所述微生物可以是枯草芽孢桿菌(bacillus?subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(bacillus?pumilus)或大腸桿菌(escherichia?coli)等。例如，出發菌株為b.subtilis?168、b.subtilis?a5(菌株b.subtilis?a5構建方法參見cn110257315b)。
13、第二方面，本專利技術提供腺苷生產菌株的構建方法，所述方法包括：利用基因工程手段，強化具有核苷生產能力的微生物中的udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因。
14、所述強化可選自以下a)-c)，或任選的組合實現的：
15、a)通過改變所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因的啟動子而增強；
16、b)通過改變所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的氨基酸序列而增強；
17、c)通過改變編碼所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的核苷酸序列而增強。
18、強化的方法可選自誘變、定點突變、同源重組等中的至少一種。
19、優選地，強化是通過如下①、②或③來實現的：
20、①將所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因與p43啟動子可操作地連接；
21、②將所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的第252位氨基酸由纈氨酸突變為異亮氨酸；
22、③所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的第252位氨基酸由纈氨酸突變為亮氨酸；
23、第三方面，本專利技術提供按照所述方法構建得到的腺苷生產菌株。
24、第四方面，本專利技術提供所述微生物或按照所述方法構建得到的腺苷生產菌株在腺苷或腺苷衍生物發酵生產或提高腺苷或腺苷衍生物發酵產量中的應用。
25、本專利技術所述腺苷衍生物包括但不限于三磷酸腺苷(atp)、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷。
26、第五方面，本專利技術提供一種生產腺苷的方法，所述方法包括如下步驟：
27、i)培養所述微生物本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種修飾的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修飾的微生物，其UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的活性增強，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的腺苷生產能力；
2.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，微生物中的UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的活性增強是由選自以下1)-3)，或任選的組合實現的：
3.根據權利要求2所述的微生物，其特征在于，采用誘變、定點突變或同源重組的方法來增強所述UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因的表達。
4.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶活性增強是通過如下A或B來實現的：
5.根據權利要求4所述的微生物，其特征在于，將所述UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的第252位氨基酸由纈氨酸突變為異亮氨酸或亮氨酸。
6.根據權利要求
7.腺苷生產菌株的構建方法，其特征在于，所述方法包括：利用基因工程手段，強化具有核苷生產能力的微生物中的UDP-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酸-D-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因；
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，強化的方法選自誘變、定點突變、同源重組中的至少一種；
9.按照權利要求7或8所述方法構建得到的腺苷生產菌株。
10.權利要求1-5任一項所述微生物或權利要求9所述腺苷生產菌株在腺苷或腺苷衍生物發酵生產或提高腺苷或腺苷衍生物發酵產量中的應用；
...【技術特征摘要】
1.一種修飾的微生物，其特征在于，所述微生物相比于未修飾的微生物，其udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的活性增強，且所述微生物相比于未修飾的微生物具有增強的腺苷生產能力；
2.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，微生物中的udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的活性增強是由選自以下1)-3)，或任選的組合實現的：
3.根據權利要求2所述的微生物，其特征在于，采用誘變、定點突變或同源重組的方法來增強所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶的編碼基因的表達。
4.根據權利要求1所述的微生物，其特征在于，udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-二氨基二聚物連接酶活性增強是通過如下a或b來實現的：
5.根據權利要求4所述的微生物，其特征在于，將所述udp-n-乙酰胞壁酰基-l-丙氨酸-d-谷氨酸-2,6-...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳濤，薛婷莉，欒明月，張孟娟，趙津津，
申請(專利權)人：廊坊梅花生物技術開發有限公司，
類型：發明
國別省市：
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