【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程，尤其涉及一種突變型雙酶催化劑、應用及(s)-玻色因合成方法。
技術介紹
1、玻色因（pro-xylane），化學名為羥丙基四氫吡喃三醇，是一種糖蛋白混合物，能夠刺激皮膚氨基葡聚糖(gags)的生成。gags是細胞外基質的主要成分，其中含有的透明質酸是gags的主要成分之一，透明質酸吸水儲水能力強，注入真皮層，可以達到填充及水嫩肌膚的效果，皮膚飽滿有彈性，從而預防皮膚老化，且易于生物降解，對人體刺激性小，廣泛應用于護膚品、彩妝、洗浴用品等行業，具有十分廣闊的市場前景。
2、(s)-玻色因最初主要使用化學法進行合成，如cn113735811a記載將乙酰丙酮和木糖合成第一中間產物，繼而縮酮、還原、脫保護得到(s)-玻色因；cn112812087a記載利用(2r,3s,4s)-2,3,4-三芐氧基戊二醛與丙酮反應合成了關鍵中間體，再進行兩步催化反應得到(s)-玻色因。然而化學合成法存在合成步驟多、反應條件復雜、成本高、污染大等問題。
3、近年來，生物酶法合成(s)-玻色因逐漸成為工業合成最主要的生產方式，這得益于生物酶法具有安全高效、催化步驟簡單、成本低廉、綠色環保等優勢。目前生物酶法分為單酶催化和多酶催化，如cn114507681a記載利用山梨糖還原酶與β-丙酮木糖苷、異丙醇、輔酶進行催化反應生成玻色因；2023年肖延銘等人使用短鏈醇脫氫酶與葡萄糖脫氫酶、甲酸脫氫酶等進行催化反應得到(s)-玻色因。單酶催化存在輔酶無法循環利用，易造成藥品浪費，增大生產成本的問題；而多種酶制劑進行催化生產
4、因此，利用雙酶催化循環，解決輔酶高效循環，并提高酶催化效率，減少反應時間，是大生產亟需要解決的問題。
技術實現思路
1、為解決現有技術不足，本專利技術提供一種突變型雙酶催化劑、應用及s構型玻色因合成方法，具體提供包含甲基乙二醛還原酶突變體和亞磷酸脫氫酶突變體的基因序列，甲基乙二醛還原酶突變體和亞磷酸脫氫酶突變體基因序列的表達載體及其宿主細胞，并提供甲基乙二醛還原酶突變體和亞磷酸脫氫酶突變體催化β-丙酮木糖苷制備(s)-玻色因的方法。
2、為了實現本專利技術的目的，擬采用以下方案：
3、本專利技術從genbank收錄的光滑念珠菌(nakaseomyces?glabratus)的甲基乙二醛還原酶gre2(a)（geneid:?2887289）作為初始甲基乙二醛還原酶，對該初始甲基乙二醛還原酶編碼基因進行定點突變,并對所獲得的突變體進行篩選,確定了影響初始甲基乙二醛還原酶酶學性質的關鍵殘基,同時獲得了具有高活性的甲基乙二醛還原酶突變體。實驗結果表明,將篩選獲得的甲基乙二醛還原酶突變體應用于以β-丙酮木糖苷、異丙醇為底物制備(s)-玻色因的催化反應中表現出良好的催化效果。
4、本專利技術的甲基乙二醛還原酶gre2(a)突變體，其蛋白質的核苷酸序列選擇如下的序列之一：
5、（1）如seq?id?no.3所示的核苷酸序列：將seq?id?no.1所示核苷酸序列的第130位纈氨酸替換為甘氨酸，第165位谷氨酸替換為蘇氨酸，第247位甘氨酸替換為精氨酸。
6、（2）如seq?id?no.4所示的核苷酸序列：將seq?id?no.1所示核苷酸序列的第130位纈氨酸替換為甘氨酸，第196位絲氨酸替換為丙氨酸，第251位天冬氨酸替換為甲硫氨酸。
7、（3）如seq?id?no.5所示的氨基酸序列：將seq?id?no.1所示氨基酸序列的第87位組氨酸替換為賴氨酸，第173位精氨酸替換為組氨酸，第203位異亮氨酸替換為纈氨酸。
8、（4）如seq?id?no.6所示的核苷酸序列：將seq?id?no.1所示核苷酸序列的第87位組氨酸替換為賴氨酸，第148位賴氨酸替換為精氨酸，第298位甘氨酸替換為脯氨酸。
9、（5）如seq?id?no.7所示的核苷酸序列：將seq?id?no.1所示核苷酸序列的第163位蘇氨酸替換為絲氨酸，第195位天冬氨酸替換為谷氨酸，第313位丙氨酸替換為亮氨酸。
10、（6）如seq?id?no.8所示的核苷酸序列：將seq?id?no.1所示核苷酸序列的第163位蘇氨酸替換為絲氨酸，第189位苯丙氨酸替換為色氨酸，第278位甘氨酸替換為脯氨酸。
11、本專利技術從genbank收錄的甲基營養菌(methylorubrum?extorquens)的亞磷酸脫氫酶ptdh（geneid:?72987700）作為初始亞磷酸脫氫酶，對該初始亞磷酸脫氫酶的編碼基因進行定點突變,并對所獲得的突變體進行篩選,確定了影響初始亞磷酸脫氫酶酶學性質的關鍵殘基,同時獲得了具有高活性的亞磷酸脫氫酶突變體。實驗結果表明,將篩選獲得的亞磷酸脫氫酶突變體應用于nadph的輔酶循環，具有良好的促進作用。
12、本專利技術的亞磷酸脫氫酶ptdh突變體，其蛋白質的核苷酸序列選擇如下的序列之一：
13、（7）如seq?id?no.9所示的核苷酸序列：將seq?id?no.2所示核苷酸序列的第133位色氨酸替換為酪氨酸，第204位亮氨酸替換為丙氨酸。
14、（8）如seq?id?no.10所示的核苷酸序列：將seq?id?no.2所示核苷酸序列的第77位甘氨酸替換為脯氨酸，第166位苯丙氨酸替換為色氨酸。
15、編碼甲基乙二醛還原酶突變體的基因，所述基因的核苷酸序列選自seq?id?no:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7、seqid?no:8所示的任一種。
16、編碼亞磷酸脫氫酶突變體的基因，所述基因的核苷酸序列選自seq?id?no.9、seqid?no.10所示的任一種。
17、本專利技術中所示的突變序列通過北京擎科生物有限公司進行大腸桿菌密碼子優化后，再全基因合成，并通過構建突變體基因的6xhis融合表達載體，例如使用pet22b、pet28a、pet32a、pcold?tf中的任意一種，其中甲基乙二醛還原酶優選為pet28a質粒，亞磷酸脫氫酶優選為pet32a質粒；所述宿主細胞選用為大腸桿菌bl21(de3)，適用于高效表達外源基因。
18、本專利技術還提供了一種(s)-玻色因合成方法,包括如下步驟:
19、(1)將上文所述的宿主細胞進行超低溫凍融破碎，獲得所述甲基乙二醛還原酶突變體和亞磷酸脫氫酶突變體；
20、(2)在反應體系中，加入如上文所述的甲基乙二醛還原酶突變體和亞磷酸脫氫酶突變體，采用反應溫度為30℃～40℃，底物為β-丙酮木糖苷,底物濃度為40g/l～100g/l，異丙醇濃度為40g/l～100g/l，亞磷酸鉀濃度為20g/l～50g/l，nadp鹽濃度為0.05g/l～0.2g/l，甲基乙二醛還原酶突變體與所述底物的質量比0.2～1:1，亞磷酸脫氫酶突變體與所述底物的質量本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種突變型雙酶催化劑，其特征在于，包括：
2.如權利要求1所述的突變型雙酶催化劑，其特征在于,所述甲基乙二醛還原酶突變體、所述亞磷酸脫氫酶突變體，二者質量比例為1～1.6:1。
3.編碼權利要求1所述甲基乙二醛還原酶突變體的基因。
4.如權利要求3所述的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列選自如SEQ?ID?NO:3、SEQ?ID?NO:4、SEQ?ID?NO:5、SEQ?ID?NO:6、SEQ?ID?NO:7、SEQ?ID?NO:8所示的任一種。
5.包含權利要求3所述基因的表達載體或重組菌。
6.編碼權利要求1所述亞磷酸脫氫酶突變體的基因。
7.如權利要求6所述的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列選自如SEQ?ID?NO:9、SEQ?ID?NO:10所示的任一種。
8.包含權利要求6所述基因的表達載體或重組菌。
9.如權利要求1所述突變型雙酶催化劑的應用，其特征在于，用于合成(S)-玻色因。
10.一種(S)-玻色因合成方法，其特征在于，采用反應溫度為30℃～
...【技術特征摘要】
1.一種突變型雙酶催化劑，其特征在于，包括：
2.如權利要求1所述的突變型雙酶催化劑，其特征在于,所述甲基乙二醛還原酶突變體、所述亞磷酸脫氫酶突變體，二者質量比例為1～1.6:1。
3.編碼權利要求1所述甲基乙二醛還原酶突變體的基因。
4.如權利要求3所述的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸序列選自如seq?id?no:3、seq?id?no:4、seq?id?no:5、seq?id?no:6、seq?id?no:7、seq?id?no:8所示的任一種。
5.包含權利要求3所述基因的表達載體或重組菌。
6.編碼權利要求1所述亞磷酸脫氫酶突變體的基因。
7.如權利要求6所述的基因,其特征在于,所述基因的核苷酸...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳生亮，劉子豪，陳鳳，顏詩樂，梁晏銘，唐德強，何江洋，董雅玲，張婷，昝奉君，
申請(專利權)人：綿陽晟氏健康科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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