【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于免疫學檢測，具體涉及一種基于crispr/cas12a系統和點擊化學的旋毛蟲檢測試劑盒及使用方法和應用。
技術介紹
1、旋毛蟲病是一種由旋毛蟲引發的食源性寄生蟲病，全球范圍內廣泛存在，對食品安全和公共衛生構成嚴重威脅。2014年，聯合國糧食及農業組織（fao）和世界衛生組織（woah）根據九項標準對寄生蟲病進行了排序，結果顯示旋毛蟲病帶來的經濟損失在24種常見食源性寄生蟲病中居首。旋毛蟲病通常由食用含有旋毛蟲幼蟲的生肉引起，其中豬是主要感染源；因此，精準且高靈敏度地檢測受旋毛蟲污染的肉類，對于保障食品安全至關重要。
2、國際旋毛蟲委員會（ict）推薦的集樣消化法是檢測旋毛蟲的“金標準”，然而，該方法在樣品處理過程中存在活幼蟲感染風險，且過程耗時費力，需經驗豐富的技術人員進行顯微鏡檢，容易出現漏檢現象；定量實時pcr（qpcr）也常用于檢測肉制品中的旋毛蟲，但其在檢測低豐度目標、定量精度和設備成本方面仍然存在局限性；因此，迫切需要一種高通量且高靈敏度的方法用于檢測肉類樣本中的旋毛蟲，以進一步保障食品安全。
3、酶聯免疫吸附試驗（elisa）因其特異性強、穩定性高，已廣泛應用于食源性寄生蟲的檢測；然而，elisa難以檢測低濃度病原體，提升其靈敏度仍是本領域技術人員需面對的一大挑戰。crispr/cas系統檢測技術具有原子級別的靈敏度、準確性和便攜性，結合適配體、抗原-抗體相互作用及酶反應等生物傳感模塊，可應用于非核酸靶標檢測中。本領域技術人員將elisa與crispr/cas12a系統有機結合，
4、點擊化學反應是一種高靈敏度的信號輸出方式，具有反應速率快、條件溫和且選擇性高的優點。銅（i）催化疊氮-炔加成（cuaac）反應是一種具有革命性意義的點擊化學反應；然而，目前用于cuaac反應的銅基納米催化劑（例如：銅納米花、銅納米酶和銅mof）的制備過程復雜且耗時，并且納米材料的儲存和運輸條件較為嚴苛，因此影響了點擊化學反應在生化分析中的實際應用。
技術實現思路
1、本專利技術為解決現有技術中的旋毛蟲檢測方法存在耗時耗力、靈敏度低、易造成漏檢，以及crispr/cas12a系統信號輸出探針、人工點擊酶復雜的制備過程、納米材料不易儲存和運輸的技術問題，提供了一種基于crispr/cas12a系統和點擊化學的旋毛蟲檢測試劑盒及使用方法和應用。
2、本專利技術的目的之一在于提供一種基于crispr/cas12a系統和點擊化學的旋毛蟲檢測試劑盒，所述試劑盒包括：crispr/cas12a體系、點擊反應體系、96孔反應板、磁珠探針、膠體金探針、洗滌液、cuso4溶液、sa溶液和標準品。
3、在本專利技術的一個優選實施例中，所述crispr/cas12a體系包括：1x?neb?2.1緩沖液3.6?ml，20?μm的grna?5?μl，10?μm的cas12a?10?μl和100?μm的含有20個胸腺嘧啶區域的dna鏈36?μl；所述的grna序列為seq?id?no.2所示。
4、在本專利技術的一個優選實施例中，所述點擊反應體系包括：0.25?mm的3-疊氮-7-羥基香豆素和2000倍稀釋的苯乙炔。
5、在本專利技術的一個優選實施例中，所述磁珠探針為標記多克隆抗體的探針，所述磁珠探針的制備方法為：
6、s1：使用0.05m、ph=6的mes緩沖液洗滌10?mg?cooh修飾的磁珠三次；
7、s2：將500?μl?4?mg/ml的edc和5.5?mg磺基-nhs添加到s1中獲得的磁珠中，并在室溫下孵育15?min進行活化；
8、s3：使用500?μl偶聯溶液洗滌s2中活化后的磁珠3次；所述偶聯溶液ph=7.5、由0.1m?na3po4和0.15?m?nacl配置獲得；
9、s4：將500?μl偶聯溶液和0.5?mg多克隆抗體混合均勻，將上述混合物在室溫條件下振蕩4?h；
10、s5：利用s3中活化后的磁珠，對s4中未結合的多克隆抗體進行磁分離，再加入500μl?0.1%的bsa，在室溫條件下搖動30?min，獲得磁珠探針；
11、s6：使用10?mm、ph=7.2的pbs洗滌s5中獲得的磁珠探針3次，重新懸浮在1?ml?pbs中，儲存在4℃條件下。
12、在本專利技術的一個優選實施例中，所述膠體金探針為標記ssdna和單克隆抗體的探針，所述膠體金探針的制備方法為：
13、將1?ml?4.2?nm的aunp與4?μl?100?mm的k2co3混合，室溫振蕩3?min；再加入10?μl0.1?mm的標記ssdna和6?μg的單克隆抗體，獲得探針；置于-20℃條件下冷凍1?h，解凍后，對上述探針進行三輪離心，每輪均在12800?g條件下離心20?min，將沉淀物重新懸浮在10?mm、ph=7.4的pbs中。
14、在本專利技術的一個優選實施例中，所述單克隆抗體為ts-wn10-1h9，所述ts-wn10-1h9單克隆抗體是由雜交瘤細胞株wn10-1h9制備獲得，所述雜交瘤細胞株wn10-1h9的保藏編號為cgmcc?no.18316。
15、在本專利技術的一個優選實施例中，所述ssdna的序列為seq?id?no.1所示。
16、在本專利技術的一個優選實施例中，所述洗滌液為pbst，所述標準品以pbs為溶劑，并包含濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50和100?ng/ml的旋毛蟲粗抗原。
17、本專利技術的目的之二在于提供上述試劑盒的非診斷目的的使用方法，所述使用方法具體包括以下步驟：
18、s11：將15?μl?10?mg/ml的磁珠探針分別與1?ml待測樣品及標準品混合，在37℃條件下孵育1?h，再使用磁鐵進行磁分離，使用洗滌液洗滌3次，獲得混合物1；
19、s22：將s11中獲得的混合物1與5?μl?84?nm的膠體金探針和95?μl?pbs混合均勻，將上述混合物置于37℃條件下孵育1?h，再使用磁鐵進行磁分離，使用洗滌液洗滌3次，獲得混合物2；
20、s33：向s22中獲得的混合物2中加入10?μl?crispr/cas12a體系，在37℃下孵育30分鐘；加入5?μl?0.5?mm的cuso4溶液和5?μl?5?mm的sa溶液，靜置2?min；加入80?μl點擊反應體系，置于37℃條件下孵育10?min，獲得處理后的待測樣品；
21、s44：對s33中獲得的樣品進行熒光強度的檢測，以標準品濃度為橫坐標，以讀取激發波長為350?nm、發射波長為460?nm的熒光強度f460值為縱坐標建立標準曲線，根據標準曲線獲得待測樣品中旋毛蟲粗抗原的含量。
22、本專利技術的目的之三在于提供上述試劑盒在旋毛本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于CRISPR/Cas12a系統和點擊化學的旋毛蟲檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：CRISPR/Cas12a體系、點擊反應體系、96孔反應板、磁珠探針、膠體金探針、洗滌液、CuSO4溶液、SA溶液和標準品。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a體系包括：1X?NEB2.1緩沖液3.6mL，20μM的gRNA5μL，10μM的Cas12a?10μL和100μM的含有20個胸腺嘧啶區域的DNA鏈36μL；所述gRNA的序列為SEQ?ID?NO.2所示。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述點擊反應體系包括：0.25mM的3-疊氮-7-羥基香豆素和2000倍稀釋的苯乙炔。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁珠探針為標記多克隆抗體的探針，所述磁珠探針的制備方法為：
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述膠體金探針為標記ssDNA和單克隆抗體的探針，所述膠體金探針的制備方法為：
6.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述單克隆抗體為
7.根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述ssDNA的序列為SEQ?ID?NO.1所示。
8.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述洗滌液為PBST，所述標準品以PBS為溶劑，并包含濃度分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50和100ng/mL的旋毛蟲粗抗原。
9.權利要求1至8任一項所述試劑盒的非診斷目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法具體包括以下步驟：
10.權利要求1至8任一項所述試劑盒在旋毛蟲檢測中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種基于crispr/cas12a系統和點擊化學的旋毛蟲檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：crispr/cas12a體系、點擊反應體系、96孔反應板、磁珠探針、膠體金探針、洗滌液、cuso4溶液、sa溶液和標準品。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述crispr/cas12a體系包括：1x?neb2.1緩沖液3.6ml，20μm的grna5μl，10μm的cas12a?10μl和100μm的含有20個胸腺嘧啶區域的dna鏈36μl；所述grna的序列為seq?id?no.2所示。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述點擊反應體系包括：0.25mm的3-疊氮-7-羥基香豆素和2000倍稀釋的苯乙炔。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述磁珠探針為標記多克隆抗體的探針，所述磁珠探針的制備方法為：
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特...
【專利技術屬性】
技術研發人員：白雪，劉明遠，王洋，于瑤，趙連靜，金雪敏，徐凝，劉曉雷，楊勇，
申請(專利權)人：吉林如諾生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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