【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種用于同時檢測aroa1、aroa2、aroa3的方法、裝置及應用，屬于檢驗檢測。
技術介紹
1、抗除草劑類基因是指那些能使植物在特定除草劑處理下仍然存活的基因。這些基因通常通過轉基因技術被導入到作物中，賦予作物對特定除草劑的抗性。這有助于簡化田間管理和減少勞動力成本。檢測抗除草劑類基因有助于驗證轉基因作物是否成功獲得了抗除草劑的特性，從而確保其在田間管理中的有效性和安全性。此外，基因檢測還可以幫助育種者優化育種策略，以及為監管機構提供科學依據以評估轉基因作物的安全性和合規性。
2、抗除草劑類基因的檢測方法主要基于核酸擴增，包括聚合酶鏈式反應(pcr)以及等溫擴增技術。因pcr擴增時間長且依賴于專業人員及設備，并不適用于現場快速檢測。環介導等溫擴增即lamp技術能夠在等溫(通常是60℃～65℃)條件下，利用鏈置換dna聚合酶(如bst?dna聚合酶)和一套特異引物，通過自循環的鏈置換dna合成完成目標核酸的快速擴增。lamp技術針對靶基因的6個特定區域設計4種特異引物，這4種引物分別為fip(正向內引物)、bip(反向內引物)、f3(正向外引物)和b3(反向外引物)。這些引物在擴增反應中起著關鍵作用，能夠確保擴增的特異性和高效性。lamp的擴增過程主要分為兩個階段：起始階段：在此階段，內引物和外引物均參與反應，它們與目標dna的特定區域結合，并在dna聚合酶的作用下進行延伸，形成雙啞鈴結構dna。這種結構為后續的循環擴增提供了模板。循環擴增階段：進入此階段后，只有內引物參與反應。內引物通過鏈置換dna
3、光觸發擴增，通過將光敏劑加入擴增體系中，用發光二極管(led)或激光等作為光源，光熱材料均勻分散于擴增體系，經led激發，有可能為核酸擴增提供能量供應。目前尚未有利用光觸發擴增技術實現多個基因同時lamp擴增的報道。使用光敏劑介導、光觸發lamp的挑戰在于需要具有更高活性的光敏劑，操作難點在于光敏劑需要與lamp體系兼容且不干擾反應；需有可精確控制的光源和光觸發條件以避免影響擴增穩定性；需開發高靈敏度、高特異性的檢測方法。
4、外同軸反射led光源與其他led光源在多個方面存在顯著的區別，主要體現在結構設計、光線特性、應用場景以及光學效率上。外同軸反射led光源主要由側向光源和分光鏡組成，光源發出的光線首先經過分光鏡，然后被平行反射至待測物上。其他led光源如環形光源、條形光源、線型光源等，它們的結構設計各不相同，但通常不包含分光鏡這一組件。例如，環形光源直接照射被測物體上方，條形光源則提供直射、斜射及測光等多種照射效果。外同軸反射led光源由于采用了分光鏡設計，光線經過分光鏡后能夠均勻照射在物體表面，減少陰影和反射造成的干擾。同時，這種光源通常具有較高的亮度和均勻性，能夠突出物體的外形輪廓特征。其他led光源雖然也具備各自的光線特性，如環形光源能夠解決對角照射陰影問題，條形光源照射角度與安裝隨意可調等，但相比之下，外同軸反射led光源在光線均勻性和減少陰影方面更具優勢。外同軸反射led光源分光鏡設計減少光損失，從而提高光學效率。
5、目前尚未有利用外同軸反射led光源激發-光觸發擴增結合光熱檢測試紙技術同時檢測抗除草劑類基因的相關報道。
技術實現思路
1、技術問題：現有抗除草劑類基因環介導等溫擴增方法具有以下局限性：無法使用瓊脂糖核酸凝膠電泳區分多重環介導等溫擴增產物；擴增時間較長，擴增效率有待提高。同時光觸發擴增技術尚未應用于同時擴增多個基因；外同軸反射led光源雖具有光線均勻性和減少陰影的優勢，但尚未與光觸發擴增及光熱檢測試紙技術結合用于檢測抗除草劑類基因。使用光敏劑介導、光觸發lamp的挑戰與操作難點在于光敏劑需與lamp體系兼容且不干擾反應；需有可精確控制的光源和光觸發條件以避免影響擴增穩定性；需開發高靈敏度、高特異性的檢測方法。
2、專利技術目的：為了克服上述的現有技術的不足與缺陷，本專利技術提供一種用于同時檢測aroa1、aroa2、aroa3的方法、裝置及應用，采用光敏劑csyf4@yb2o3作為光熱材料，利用其光致活性產生光電子和光熱效應，在808nm外同軸反射led光源照射下，實現快速控溫且與擴增體系在分子層面直接接觸，光熱效率顯著提高，然后再進行光熱檢測試紙顯色檢測，從而實現光觸發擴增和光熱檢測試紙檢測兩個環節的集約化高效擴增及檢測。
3、技術方案：本專利技術采用以下技術方案。
4、本專利技術的第一個目的是，提供一種利用光敏劑csyf4@yb2o3光熱效應實現抗除草劑基因aroa1、aroa2、aroa3光觸發lamp及檢測的方法。該方法包括光觸發擴增和光熱檢測試紙檢測兩個環節。利用808nm外同軸反射led光源照射擴增體系，激發擴增體系中的光敏劑csyf4@yb2o3產生光電子和熱，為lamp提供能量，使aroa1、aroa2、aroa3作為模板引發擴增反應，獲得大量雙鏈dna擴增產物；然后，通過光熱檢測試紙以夾心形式捕獲擴增產物和信號探針，給出與擴增產物含量正相關的光熱溫變信號，實現目的基因的定量檢測。所述等溫擴增體系包括以下組分：引物組、光敏劑csyf4@yb2o3、dna模板、bst3.0?dna聚合酶以及等溫擴增緩沖液。
5、具體的，本專利技術一種用于同時檢測aroa1、aroa2、aroa3的方法，包括以下步驟：
6、s1、制備光敏劑csyf4@yb2o3
7、s2、光觸發lamp擴增
8、在光敏劑csyf4@yb2o3介導下，使用808nm外同軸反射led光源的照射，待測樣品經光觸發lamp體系進行擴增反應，得到擴增產物，其中，
9、所述光觸發lamp體系體系包括以下組分：光敏劑csyf4@yb2o3及dna模板，所述dna模板為抗除草劑類基因aroa1、aroa2、aroa3。
10、s3、光熱檢測試紙檢測
11、在試紙的t區和c區固定捕獲探針，得到針對目標基因aroa1、aroa2、aroa3光觸發lamp產物的多靶標光熱檢測試紙
12、分別以aroa1、aroa2、aroa3的核酸鏈修飾光敏劑csyf4@yb2o3得到光熱信號探針；
13、使用所述光熱信號探針及所述光熱檢測試紙檢測所述擴增產物，光熱檢測試紙的檢測區以夾心形式捕獲擴增產物和光熱信號探針，并在808nm外同軸反射led光源照射下給出與擴增產物含量正相關的光熱溫變信號，根據該溫變信號對待測樣品中aroa1、aroa2、aroa3定性和/或定量。
14、作為一種可選的實施方式，所述光觸發lamp體系中，每組dna模板的濃度為3％-5％v/v。
15、作為一種可選的實施方式，所述光觸發lamp體系中還包括引物，所述引物組包括三組引物，每組引物包括兩個外部引物f3和b3、兩個內部引物fip和bip，及兩個本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于同時檢測aroA1、aroA2、aroA3的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述光觸發LAMP體系中，每組DNA模板的濃度為3％-5％v/v；
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述外同軸反射LED光源的照射參數為功率4.5-6W，照射時間10-60min。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，光熱信號探針獨立于光熱檢測試紙主體使用，或者滴加并干燥在結合墊上并將結合墊整合于光熱檢測試紙上。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述光敏劑CsYF4@Yb2O3的制備方法包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述Y(NO3)3所用體積為0.8-1.0mL，Yb2O3所用體積為0.1-0.3mL。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述NH4F和CsF所用體積為2-4mL。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述干燥包括，在烘箱中65-75℃干燥2-3h。<...
【技術特征摘要】
1.一種用于同時檢測aroa1、aroa2、aroa3的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述光觸發lamp體系中，每組dna模板的濃度為3％-5％v/v；
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述外同軸反射led光源的照射參數為功率4.5-6w，照射時間10-60min。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，光熱信號探針獨立于光熱檢測試紙主體使用，或者滴加并干燥在結合墊上并將結合墊整合于光熱檢測試紙上。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述光敏劑csyf4@yb2o3的制備方法包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(2)中所述y(no3)3所用體積為0.8-1.0ml，yb2o3所用體積為0.1-0.3ml。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步...
【專利技術屬性】
技術研發人員：唐銳，劉曉蘭，關薇，余柳鋒，張毅，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發明
國別省市：
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