【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及動物模型，具體涉及一種mn1-bend2融合基因敲入小鼠動物模型的構建方法及其作為星形母細胞瘤動物模型的應用。
技術介紹
1、星形母細胞瘤是好發于兒童以及青少年中的中樞神經系統腫瘤，由于發病機制未知，因此缺乏特異性治療方式。目前尚無星形母細胞瘤相關的動物模型機細胞模型，因此限制了對星形母細胞瘤發病機制的探究以及相關靶向藥物的研發。
2、mn1:bend2融合基因是星形母細胞瘤患者中最常見的融合基因突變，并且在星形母細胞瘤復發患者中高表達，融合基因突變在腫瘤發生中扮演重要作用，因此mn1:bend2融合基因突變可能參與了星形母細胞瘤的腫瘤進展。
3、cre：loxp-stop-loxp轉基因小鼠系統可以滿足目的基因在特異性細胞類型中進行表達，從而滿足對目的基因的細胞特異性功能探究。
技術實現思路
1、專利技術目的
2、針對現有技術中存在的問題或需求，本專利技術的目的在于提供一種mn1-bend2融合基因敲入小鼠動物模型的構建方法及其作為星形母細胞瘤動物模型的應用。
3、解決方案
4、為了實現上述目的，本專利技術提供了如下技術方案：
5、第一方面，本專利技術提供了一種用于構建mn1-bend2融合基因敲入的轉基因小鼠的特異性靶位點導向rna(簡稱“grna”)，所述特異性靶位點導向rna的核苷酸序列如下：
6、5’-gaacactagtgcacttatcc-3’(即，seq?id?no:1
7、在可行的實施方案中，待敲入的所述mn1-bend2融合基因的序列如seq?id?no:2所示。所述mn1:bend2融合基因表達一種融合蛋白，該融合蛋白為由mn1的外顯子1與bend2的外顯子7-14融合而成的蛋白。
8、在可行的實施方案中，所述mn1-bend2融合基因的敲入位點為小鼠11號染色體h11位點。
9、第二方面，本專利技術提供了一種用于構建mn1-bend2融合基因敲入的轉基因小鼠動物模型的crispr-cas9基因編輯系統，其特征在于，所述crispr-cas9基因編輯系統包括：
10、如第一方面所述的特異性靶位點導向rna，cas9?mrna，和包含待敲入的mn1-bend2融合基因的同源重組載體。
11、在可行的實施方案中，待敲入的mn1-bend2融合基因的序列如seq?id?no:2所示。
12、在可行的實施方案中，所述cas9?mrna的序列如seq?id?no:3所示。
13、在可行的實施方案中，所述同源重組載體中，在啟動子和所述mn1-bend2融合基因之間具有loxp-stop-loxp元件，以實現所述mn1-bend2融合基因的cre依賴性表達；所述loxp-stop-loxp元件為轉錄沉默元件，在沒有cre酶的情況下，其下游基因將無法正常表達；在引入cre酶后，該轉錄沉默元件的stop序列被刪除后，下游基因可以正常表達，從而實現基因cre依賴的表達。
14、在可行的實施方案中，所述同源重組載體包含5’同源臂和3’同源臂；優選地，所述5’同源臂具有如seq?id?no:4所示的序列，所述3’同源臂具有如seq?id?no:5所示的序列。
15、第三方面，本專利技術提供了如上述第一方面所述的特異性靶位點導向rna或者如上述第二方面所述的crispr-cas9基因編輯系統在制備mn1-bend2融合基因敲入小鼠動物模型中的應用。
16、第四方面，本專利技術提供了一種構建mn1-bend2融合基因敲入小鼠動物模型的方法，所述方法使用如上述第一方面所述的特異性靶位點導向rna或者如上述第二方面所述的crispr-cas9基因編輯系統。
17、在可行的具體實施方案中，所述方法包括：
18、(1)將特異性靶位點導向rna和cas9體外轉錄成mrna，獲得有活性的grna和cas9mrna；
19、(2)構建同源重組載體；
20、(3)有活性的grna、cas9?mrna和同源重組載體一起顯微注射到供體小鼠的受精卵中，然后將受精卵移植到受體小鼠中進行孕育，獲得子代小鼠，通過基因型鑒定，篩選獲得f0代小鼠；以及
21、(4)將f0代小鼠與野生型異性小鼠交配，獲得子代小鼠，通過基因型鑒定，篩選獲得f1代mn1-bend2融合基因敲入雜合子小鼠。
22、可選地，所述方法還包括：
23、(5)將步驟(4)所得f1代mn1-bend2融合基因敲入雜合子小鼠與特異性表達cre的異性小鼠交配，獲得子代小鼠，通過基因型鑒定，篩選子代中同時表達mn1-bend2融合基因和cre的小鼠。
24、在可行的實施方案中，所述小鼠的品系均為c57bl/6j。
25、在可行的實施方案中，用于鑒定f0代、f1代小鼠的mn1-bend2融合基因基因型的pcr引物組包括如seq?id?no:6、7、8和9所示的引物。
26、在可行的實施方案中，特異性表達cre的小鼠為誘導所述融合基因在中樞神經系統中神經干細胞中表達的cre小鼠(例如，實施例中所用的nestincreer小鼠)，或者為誘導所述融合基因在腹側神經干細胞中表達的cre小鼠(例如，實施例中所用的olig2cre小鼠)。
27、作為優選，當特異性表達cre的小鼠為nestincreer小鼠時，用于鑒定同時表達mn1-bend2融合基因和cre的小鼠的pcr引物組包括如seq?id?no:10、11、12和13所示的引物；當特異性表達cre的小鼠為olig2cre小鼠時，用于鑒定同時表達mn1-bend2融合基因和cre的小鼠的pcr引物組包括如seq?id?no:14、15和16所示的引物。
28、第五方面，本專利技術提供了根據上述第四方面所述的方法構建的mn1-bend2融合基因敲入小鼠動物模型作為星形母細胞瘤動物模型在研究星形母細胞瘤的發生、發展機制或篩選星形母細胞瘤的治療藥物中的應用。
29、有益效果
30、本專利技術設計了通過crispr-cas9技術向小鼠基因組特定位點敲入mn1-bend2融合基因的特異性靶位點導向rna(sgrna)，基于該sgrna的crispr-cas9基因編輯系統，并提供了利用所述sgrna或所述crispr-cas9基因編輯系統構建mn1-bend2融合基因敲入小鼠動物模型的方法，以及所構建的小鼠動物模型作為星形母細胞瘤動物模型的應用。
31、根據本專利技術所述方法構建mn1-bend2融合基因敲入小鼠動物模型具有較高的成功率(轉基因小鼠陽性率在11.6％以上)，并且所述mn1-bend2融合基因在該小鼠動物模型中的表達效率較高。
32、并且，根據本專利技術所述方法所構建的mn1-bend2融合基因敲入小鼠動物模型為cre依賴性表達mn1-bend2融合基因的動物模型，當將其與特異性表本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于構建MN1-BEND2融合基因敲入的轉基因小鼠的特異性靶位點導向RNA，其特征在于，所述特異性靶位點導向RNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示。
2.根據權利要求1所述的特異性靶位點導向RNA，其特征在于，待敲入的所述MN1-BEND2融合基因的序列如SEQ?ID?NO:2所示；
3.一種用于構建MN1-BEND2融合基因敲入的轉基因小鼠動物模型的CRISPR-Cas9基因編輯系統，其特征在于，所述CRISPR-Cas9基因編輯系統包括：
4.根據權利要求3所述的CRISPR-Cas9基因編輯系統，其特征在于，所述MN1-BEND2融合基因的序列如SEQ?ID?NO:2所示；
5.如權利要求1或2所述的特異性靶位點導向RNA或者如權利要求3或4所述的CRISPR-Cas9基因編輯系統在制備MN1-BEND2融合基因敲入小鼠動物模型中的應用。
6.一種構建MN1-BEND2融合基因敲入小鼠動物模型的方法，其特征在于，所述方法使用如權利要求1或2所述的特異性靶位點導向RNA或者如權利要求3或4所述的CRI
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法還包括：
9.根據權利要求6-8任一項所述的方法，其特征在于，所述小鼠的品系均為C57BL/6J；
10.根據權利要求6-9任一項所述的方法構建的MN1-BEND2融合基因敲入小鼠動物模型作為星形母細胞瘤動物模型在研究星形母細胞瘤的發生、發展機制或篩選星形母細胞瘤的治療藥物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種用于構建mn1-bend2融合基因敲入的轉基因小鼠的特異性靶位點導向rna，其特征在于，所述特異性靶位點導向rna的核苷酸序列如seq?id?no:1所示。
2.根據權利要求1所述的特異性靶位點導向rna，其特征在于，待敲入的所述mn1-bend2融合基因的序列如seq?id?no:2所示；
3.一種用于構建mn1-bend2融合基因敲入的轉基因小鼠動物模型的crispr-cas9基因編輯系統，其特征在于，所述crispr-cas9基因編輯系統包括：
4.根據權利要求3所述的crispr-cas9基因編輯系統，其特征在于，所述mn1-bend2融合基因的序列如seq?id?no:2所示；
5.如權利要求1或2所述的特異性靶位點導向rna或者如權利要求3或4所述的cris...
【專利技術屬性】
技術研發人員：石瑋，于洋，石一星，孫倩倩，謝香玉，
申請(專利權)人：北京腦科學與類腦研究所，
類型：發明
國別省市：
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