本發明專利技術涉及細胞生物學領域，具體的，本發明專利技術涉及一種腫瘤反應性非耗竭T細胞亞型及其分離、鑒定方法。本發明專利技術申請人在研究中首次發現了一種新型腫瘤反應性非耗竭T細胞亞型(Tumor?reactive?Non?exhausted?T?cell,TNT)，命名為CD8_HLA?DRA+Tem，并提供該細胞亞型的分離和鑒定方法，在多色免疫組化實驗中，通過CD8+、HLA?DR+和TIM?3?可定位到該亞型，通過對該亞型細胞功能分析發現，這種亞型具有抗腫瘤功能。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞生物學領域，具體的，本專利技術涉及一種腫瘤反應性非耗竭t細胞亞型及其分離、鑒定方法。
技術介紹
1、作為細胞免疫的執行者，t細胞有著較大的功能狀態差異。t細胞可以根據cd3表面蛋白的表達與其他免疫細胞進行區分。經典的t細胞包含初始t細胞、效應t細胞(effectortcell，teff，也稱為細胞毒性t細胞，cytotoxic?t?cells，ctl)和記憶t細胞(memory?tcell，tm)，其中初始t細胞在遇到抗原刺激后可分化為后兩者。tm又可分為中央記憶t細胞(central?memory?t?cell,tcm)、效應記憶t細胞(effector?memoryt?cell,tem)和組織駐留記憶t細胞(tissue?resident?memory?t?cell，trm)等。
2、t細胞通過細胞表面的t細胞受體(t?cell?receptor，tcr)識別mhc-抗原復合物。能夠特異性識別腫瘤抗原的tcr所在的t細胞稱為腫瘤響應t細胞(tumor-reactive?tcell)，不能特異性識別腫瘤抗原的t細胞稱為旁觀者t細胞(bystander?t?cell)。在腫瘤微環境中，由于腫瘤抗原對tcr的長時間刺激，腫瘤響應t細胞的細胞毒性通常會下降，此過程稱為t細胞耗竭(t?cell?exhaustion)。隨著t細胞耗竭，其細胞增殖能力逐漸下降，效應功能逐漸降低，并伴隨著共抑制受體表達增加，如pd-1(pdcd1)、lag-3(lag3)、ctla4、tim-3(havcr2)等。
>3、我們前期通過分析胃癌相關單細胞轉錄組數據發現一種t細胞亞型比較特殊，利用與耗竭性t細胞共享tcr提示腫瘤抗原特異性，發現部分腫瘤反應性t細胞其不僅具備耗竭性t細胞對腫瘤抗原響應的特點，同時不具備耗竭性特征。通過公共數據證實該細胞亞型存在于多種腫瘤組織中，但是之前并未被單獨識別、分離和鑒定。
技術實現思路
1、在對t細胞的研究過程中，申請人意外的發現了一種新型腫瘤反應性非耗竭t細胞亞型，該亞型為首次被發現。基于此，本專利技術提供如下的技術方案：
2、首先，在第一方面，本專利技術提供了一種腫瘤反應性非耗竭t(tnt)細胞亞型的分離方法，所述方法包括通過流式細胞術對cd8+hla-dr+tim-3-細胞進行分選。
3、在一種實施方式中，所述方法包括如下步驟：
4、1、收集細胞至樣品管并調整細胞濃度至1×10^6個細胞/100ul，采用2ml?pbs洗滌細胞后500g離心5分鐘，棄去上清，重復2次，然后使用流式細胞染色buffer液體100ul重懸細胞，添加5～10ul?7-aad染料至細胞懸液，均勻混合并在4℃條件下避光孵育30分鐘，采用流式細胞儀檢測7-aad染色情況，去除死細胞；
5、3采用抗fc抗體封閉液加入洗滌后的細胞懸液進行封閉孵育；
6、4重復以上步驟1染色標記cd45、cd3、cd8、hla-dr、tim-3共5種抗體，標記孵育1小時后洗滌細胞2次，然后重懸為單細胞懸液；
7、5流式分選儀器開始進行細胞分選，根據設置的熒光強度和細胞圈門等參數，成功分選出cd8+hla-dr+tim-3-細胞即為tnt細胞。
8、本專利技術的第二個方面，提供一種腫瘤反應性非耗竭t細胞亞型的鑒定方法，所述方法包括對樣本進行cd8、hla-dr、tim-3三個蛋白的多色免疫組織化學染色，cd8+hla-dr+tim-3-細胞即為腫瘤反應性非耗竭t細胞亞型。
9、本專利技術的第三個方面，提供腫瘤反應性非耗竭t細胞亞型在制備抗腫瘤藥物中的應用。
本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種腫瘤反應性非耗竭T(TNT)細胞亞型的分離方法，其特征在于，所述方法包括通過流式細胞術對CD8+HLA-DR+TIM-3-細胞進行分選。
2.如權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
3.一種腫瘤反應性非耗竭T細胞亞型的鑒定方法，其特征在于，所述方法包括對樣本進行CD8、HLA-DR、TIM-3三個蛋白的多色免疫組織化學染色，CD8+HLA-DR+TIM-3-細胞即為腫瘤反應性非耗竭T細胞亞型。
4.如權利要求1所述的分離方法獲得的腫瘤反應性非耗竭T細胞亞型在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【技術特征摘要】
1.一種腫瘤反應性非耗竭t(tnt)細胞亞型的分離方法，其特征在于，所述方法包括通過流式細胞術對cd8+hla-dr+tim-3-細胞進行分選。
2.如權利要求1所述的分離方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：
3.一種腫瘤反應性非耗竭t細胞亞型的鑒定...
【專利技術屬性】
技術研發人員：步召德，高歌，馮夢宇，魏琳，季加孚，
申請(專利權)人：北京腫瘤醫院北京大學腫瘤醫院，
類型：發明
國別省市：
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