【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥領域，具體涉及一種多糖修飾脂質體納米疫苗及其制備方法和應用。
技術介紹
1、在全球范圍內，由呼吸道黏膜病原體引起的感染性疾病仍具有較高的死亡率和發病率，在低收入地區情況更為嚴重。疫苗作為現代醫學最偉大的成就之一，疫苗接種可有效降低傳染性疾病患病率及死亡率，然而，目前已上市的疫苗并未有效覆蓋所有的呼吸道病原體的預防，例如預防流感病毒、結核分枝桿菌、肺炎鏈球菌和百日咳鮑特菌感染的疫苗雖已上市，但多為注射給藥方式，很難在病原體入侵的黏膜表面誘導抗原特異性免疫應答，導致預防效果仍不夠理想。除了少數使用維甲酸作為佐劑可誘導粘膜組織分泌iga的報道外，通過常規肌肉注射途徑接種的疫苗只會誘導以血清igg為特征的全身免疫反應，在清除病毒粒子方面能力有限。相較于注射型疫苗，肺部吸入疫苗不僅能激發體液免疫和細胞免疫，還能激發鼻腔和氣道組織中的抗體，達到高效誘導黏膜免疫的目的，在感染位點阻斷病原體的感染及其進一步的擴散和傳播，最終實現三重免疫保護。此外，減少了抗原劑量以及接種頻率并能實現與注射疫苗同等效力的保護性免疫，大大提高了安全性、便利性和依從性。
2、傳統疫苗在安全性和制備周期方面存在弊端，技術的進步以及對安全無害且具有成本效益的追求促使了亞單位疫苗的開發。亞單位疫苗的免疫原性一般較差，需要加入佐劑才能誘導強而持久的保護性免疫應答。根據作用方式的不同，佐劑分為遞送系統和免疫刺激/調節/增強劑。然而，目前匱乏可吸入的安全有效的免疫佐劑。相比之下，納米遞送系統以明確的成分、穩定的結構和特殊的理化性質，極大促進了黏膜
3、許多多糖具有促進機體特異性免疫和非特異性免疫的作用，且具有低毒、安全等特點，可能成為理想的疫苗佐劑。作為遞送系統，幫助抗原識別并被抗原呈遞細胞攝取。同時作為模式識別受體(prrs)激動劑，激活并啟動級聯免疫反應。此外，多糖與其他免疫佐劑制成復合佐劑產生協同效應從而引發更加強烈全面免疫效果。通過與陰離子多糖的簡單絡合，可以改變脂質體的免疫刺激特性，增加其穩定性，克服上述脂質體存在的問題。研究表明，多糖的構象、分子量、存在的某些官能團以及分支程度可能與其免疫刺激功能有關。多糖的構象也可影響其與免疫分子或細胞的相互作用，從而影響其免疫調節作用。
4、鑒于此，目前需要開發安全有效的可吸入多糖佐劑系統，并解決亞單位抗原肺部遞送中的各種難題，最終將最優激活免疫效應的具有普適性的多糖佐劑應用于肺部疾病的免疫治療。
技術實現思路
1、本專利技術提供一種多糖修飾脂質體納米疫苗，尤其是提供一種可吸入的增強肺部黏膜免疫的多糖修飾脂質體納米疫苗，以解決亞單位抗原或佐劑肺部遞送不穩定、較差的免疫原性及陽離子脂質體毒性和肺部遞送屏障的問題。本專利技術提供了可吸入用于增強肺部黏膜免疫的多糖修飾脂質體納米疫苗，由不同結構多糖外殼和陽離子脂質體內核組成；所述陽離子脂質體內核載陰離子抗原ova或佐劑。
2、一種多糖修飾脂質體納米疫苗，所述納米疫苗由含有d-葡萄糖醛酸骨架的陰離子多糖外殼和包覆于多糖外殼中的載藥陽離子脂質體內核組成，其中，所述陽離子脂質體內核載有陰離子抗原ova。
3、上述技術方案中，所述納米疫苗為顆粒，平均粒徑為100～650nm，表面電荷為-10～-40mv。
4、上述技術方案中，所述含有d-葡萄糖醛酸骨架的多糖選自透明質酸(ha)、硫酸軟骨素(sc)、硫酸乙酰肝素(sh)中的一種或幾種。
5、上述技術方案中，所述制備陽離子脂質體的原料包括肺內源性磷脂、陽離子脂質和膽固醇。
6、進一步地，所述肺內源性磷脂為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油中的一種或多種。
7、進一步地，所述陽離子脂質選自2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨(dotap)、二甲基雙十八烷基銨(dda)、3β-[n-(n’,n’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇(dc-chol)中的一種或多種。
8、更進一步地，所述肺內源性磷脂、陽離子脂質和膽固醇的摩爾比為120～40：40～20：10。
9、本專利技術所述陰離子多糖與陽離子脂質的比例以滿足最終多糖修飾脂質體納米疫苗表面電荷為-10～-40mv為準。
10、本專利技術的另一目的是提供上述多糖修飾的脂質體納米疫苗的制備方法。
11、一種多糖修飾的脂質體納米疫苗的制備方法，將溶解后的脂質膜材與陰離子抗原ova混合，高速剪切、旋蒸揮發、水化，得到載藥陽離子脂質體；將多糖溶于超純水中，將上述載藥陽離子脂質體溶液逐滴加入，得到多糖修飾的脂質體納米疫苗。
12、上述技術方案中，所述脂質溶液的濃度為2～15mg/ml，所述ova溶液的濃度為0.01～5mg/ml，所述脂質溶液與陰離子抗原ova溶液的體積比為1:1～10:1。
13、上述技術方案中，所述多糖溶液的濃度為0.1～2mg/ml，所述載藥陽離子脂質體溶液與多糖溶液的體積比為0.2:1～5:1。
14、以dppc為例，所述載藥陽離子脂質體按下述方法制得：將dppc、dotap和膽固醇以一定的摩爾比充分溶解于氯仿中配制成脂質溶液作為油相。室溫條件下，加入ova水相并進行高速剪切處理，得到油包水初乳；初乳在一定條件下旋蒸并充分水化，隨后進一步進行超聲處理，得載藥陽離子脂質體(簡稱為dppc/dotap?liposome)。
15、進一步地，將dppc/dotap?liposome與多糖溶液充分混合，室溫孵育15min，超濾除去游離ova及多糖，也可以不除去游離ova及多糖。
16、本專利技術的又一目的是提供上述多糖修飾的脂質體納米疫苗在制備肺部、鼻腔、眼部、口腔、陰道黏膜遞送亞單位疫苗或佐劑載體中的應用。
17、進一步地，提供所述多糖修飾的脂質體納米疫苗在制備吸入的用于增強肺部黏膜免疫的疫苗中的應用。
18、與現有本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種多糖修飾脂質體納米疫苗，其特征在于，所述納米疫苗由含有D-葡萄糖醛酸骨架的陰離子多糖外殼和包覆于多糖外殼中的載藥陽離子脂質體內核組成，其中，所述陽離子脂質體內核載有陰離子抗原OVA。
2.根據權利要求1所述的多糖修飾的脂質體納米疫苗，其特征在于，所述含有D-葡萄糖醛酸骨架的多糖選自透明質酸(HA)、硫酸軟骨素(SC)、硫酸乙酰肝素(SH)中的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的多糖修飾的脂質體納米疫苗，其特征在于，所述制備陽離子脂質體的原料包括肺內源性磷脂、陽離子脂質和膽固醇。
4.根據權利要求3所述的多糖修飾的脂質體納米疫苗，其特征在于，所述肺內源性磷脂為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油中的一種或多種。
5.根據權利要求3所述的多糖修飾的脂質體納米疫苗，其特征在于，所述陽離子脂質選自2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨(DOTAP)、二甲基雙十八烷基銨(DDA)、3β-[N-(N’,N’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇(DC-Chol)中的一種或多種。
6.根據權利要求1所述的多糖修飾的脂質體
7.權利要求1所述多糖修飾的脂質體納米疫苗的制備方法，其特征在于，將溶解后的脂質膜材與陰離子抗原OVA混合，高速剪切、旋蒸揮發、水化，得到載藥陽離子脂質體；將多糖溶于超純水中，將上述載藥陽離子脂質體溶液逐滴加入，得到多糖修飾的脂質體納米疫苗。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述脂質溶液的濃度為2～15mg/mL，所述OVA溶液的濃度為0.01～5mg/mL，所述脂質溶液與陰離子抗原OVA溶液的體積比為1:1～10:1；所述多糖溶液的濃度為0.1～2mg/mL，所述載藥陽離子脂質體溶液與多糖溶液的體積比為0.2:1～5:1。
9.權利要求1所述多糖修飾的脂質體納米疫苗在制備肺部、鼻腔、眼部、口腔、陰道黏膜遞送亞單位疫苗或佐劑載體中的應用。
10.根據權利要求9所述的的應用，其特征在于，所述多糖修飾的脂質體納米疫苗在制備吸入的用于增強肺部黏膜免疫的疫苗中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種多糖修飾脂質體納米疫苗，其特征在于，所述納米疫苗由含有d-葡萄糖醛酸骨架的陰離子多糖外殼和包覆于多糖外殼中的載藥陽離子脂質體內核組成，其中，所述陽離子脂質體內核載有陰離子抗原ova。
2.根據權利要求1所述的多糖修飾的脂質體納米疫苗，其特征在于，所述含有d-葡萄糖醛酸骨架的多糖選自透明質酸(ha)、硫酸軟骨素(sc)、硫酸乙酰肝素(sh)中的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的多糖修飾的脂質體納米疫苗，其特征在于，所述制備陽離子脂質體的原料包括肺內源性磷脂、陽離子脂質和膽固醇。
4.根據權利要求3所述的多糖修飾的脂質體納米疫苗，其特征在于，所述肺內源性磷脂為磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油中的一種或多種。
5.根據權利要求3所述的多糖修飾的脂質體納米疫苗，其特征在于，所述陽離子脂質選自2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化銨(dotap)、二甲基雙十八烷基銨(dda)、3β-[n-(n’,n’-二甲基胺乙基)胺基甲酰基]膽固醇(dc-chol)中的一種或多種。
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