【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法。
技術(shù)介紹
1、尋常痤瘡是一種慢性炎癥性毛囊皮脂腺單位皮膚病，好發(fā)于青少年，但可以持續(xù)至成年。青少年發(fā)病率高達(dá)93%，已成為全球第八大慢性疾病，易出現(xiàn)炎癥后紅斑和色素沉著，嚴(yán)重影響患者容貌和身心健康（eichenfield,?d.?z.,?sprague,?j.,&eichenfield,l.?f.?2021.?management?of?acne?vulgaris:?a?review.?jama,?326(20):?2055–2067）。目前認(rèn)為尋常痤瘡發(fā)病主要與雄激素誘導(dǎo)皮脂腺肥大過(guò)度分泌皮脂、毛囊導(dǎo)管口異常角化、痤瘡丙酸桿菌等微生物增殖和免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。（harper,?j.?c.?2020.?acnevulgaris:?what’s?new?in?our?40th?year.?journal?of?the?american?academy?ofdermatology,?82(2):?526–527）。
2、目前對(duì)于研究尋常痤瘡發(fā)病機(jī)制及研發(fā)尋常痤瘡新型治療藥物的體外實(shí)驗(yàn)主要集中于細(xì)胞層面。動(dòng)物模型的建立在探究尋常痤瘡發(fā)病機(jī)制和藥物研發(fā)中起著重要作用，然而目前還沒(méi)有一種能覆蓋人類尋常痤瘡所有致病因素的動(dòng)物模型?，F(xiàn)有尋常痤瘡動(dòng)物模型如敘利亞倉(cāng)鼠、兔耳、犀牛鼠、hr-1小鼠等，只能用于探究尋常痤瘡發(fā)病機(jī)制的某些環(huán)節(jié)，而無(wú)法揭示其相互作用的復(fù)雜性。（kanwar,?i.?l.,?haider,?t.,?kumari,?a.,?dubey
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)要解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有尋常痤瘡動(dòng)物模型多為外用化學(xué)物質(zhì)引起，以及痤瘡丙酸桿菌作為毛囊皮脂腺常駐菌，當(dāng)前部分動(dòng)物模型注射痤瘡丙酸桿菌懸浮菌而不是生物膜，難以在體外動(dòng)物模型上模擬尋常痤瘡炎性皮損形成的問(wèn)題。
2、申請(qǐng)人經(jīng)研究認(rèn)為，痤瘡丙酸桿菌為寄生在人類毛囊皮脂腺單位的常駐菌。痤瘡丙酸桿菌菌種亞型的改變和生物膜的形成常誘發(fā)尋常痤瘡發(fā)病。事實(shí)上，痤瘡患者皮損中及周圍正常皮膚的毛囊皮脂腺單位內(nèi)可見(jiàn)痤瘡丙酸桿菌生物膜。生物膜一旦形成，不僅致病性增加，其對(duì)抗菌藥物的耐藥性也增加。實(shí)際上，在尋常痤瘡發(fā)病中起關(guān)鍵致病作用的是痤瘡丙酸桿菌生物膜而不是定植于正常毛囊皮脂腺單位的痤瘡丙酸桿菌本身。
3、基于上述研究，本專利技術(shù)提供一種構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，通過(guò)體外構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜，并將痤瘡丙酸桿菌生物膜混懸液皮內(nèi)注射于icr小鼠耳部皮膚中。該方法的具體步驟如下：
4、1、使用痤瘡丙酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株atcc11827，在24孔板預(yù)先放置的細(xì)胞爬片上，體外連續(xù)培養(yǎng)以構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜，收集生物膜懸液。
5、2、采用雌性spf級(jí)icr小鼠，在小鼠耳部皮膚皮內(nèi)注射預(yù)先體外構(gòu)建的痤瘡丙酸桿菌生物膜，待小鼠蘇醒后放入籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。
6、3、皮內(nèi)注射痤瘡丙酸桿菌生物膜、使注射區(qū)域形成肉眼可見(jiàn)的炎癥反應(yīng)后，觀察鼠耳實(shí)驗(yàn)區(qū)域形態(tài)，切除實(shí)驗(yàn)區(qū)域組織進(jìn)行he染色及免疫組化染色，當(dāng)鼠耳實(shí)驗(yàn)區(qū)域出現(xiàn)炎性紅斑丘疹膿皰等類似尋常痤瘡的皮損表現(xiàn)及相應(yīng)組織病理學(xué)特征，皮損組織免疫組化顯示相對(duì)于相同手法注射pbs的對(duì)照組il-1β的表達(dá)量增加，表明痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型構(gòu)建成功。
7、申請(qǐng)人經(jīng)反復(fù)預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：
8、上述步驟1）中，選擇體外培養(yǎng)第8天的痤瘡丙酸桿菌生物膜為宜，時(shí)間過(guò)短痤瘡丙酸桿菌未形成生物膜，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)體外痤瘡丙酸桿菌生物膜崩解。
9、上述步驟1）中，連續(xù)涂板計(jì)數(shù)后用pbs調(diào)整痤瘡丙酸桿菌生物膜懸液濃度為2×108cfu/ml。
10、上述步驟2）中，選用周齡為6-8周的icr小鼠為宜。
11、上述步驟2）中，皮內(nèi)注射部位選擇鼠耳近耳根部位中后2/3為宜，避開(kāi)肉眼可見(jiàn)血管，太靠外緣注射時(shí)會(huì)穿透皮膚，靠?jī)?nèi)難以穿透。
12、上述步驟2）中，痤瘡丙酸桿菌生物膜的注射量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致皮膚組織結(jié)構(gòu)破壞，注射量過(guò)少難以形成肉眼可見(jiàn)的炎癥反應(yīng)，因此注射量為0.1ml為宜。
13、上述步驟3）中，痤瘡丙酸桿菌生物膜感染鼠耳時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致皮膚組織結(jié)構(gòu)破壞，時(shí)間過(guò)短難以形成肉眼可見(jiàn)的炎癥反應(yīng)，基于此感染時(shí)間為48h，即48小時(shí)后再觀察鼠耳實(shí)驗(yàn)區(qū)域形態(tài)，切除實(shí)驗(yàn)區(qū)域組織進(jìn)行he染色及免疫組化染色。
14、相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和進(jìn)步：
15、1、本專利技術(shù)應(yīng)用icr小鼠做動(dòng)物模型，鼠耳皮膚分為表皮、真皮及皮下組織，且含有皮膚附屬器，如：毛囊及皮脂腺。小鼠耳皮膚薄，毛發(fā)短，更易于觀察形成皮損情況。
16、2、通過(guò)制備痤瘡丙酸桿菌生物膜的步驟可以模擬尋常痤瘡患者毛囊皮脂腺單位內(nèi)起致病作用的痤瘡丙酸桿菌生物膜及細(xì)胞外基質(zhì)成分，達(dá)到痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損的動(dòng)物模型目的。
17、3、本專利技術(shù)通過(guò)皮內(nèi)注射的方式，可以成功的觀察到本專利技術(shù)小鼠動(dòng)物模型和尋常痤瘡患者一樣的丘疹膿皰臨床皮損表現(xiàn)，此外在小鼠組織病理中可以觀察到與尋常痤瘡患者組織病理類似的毛囊角栓、中性粒細(xì)胞聚集、真皮層水腫等病理學(xué)特征，符合作為痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的要求，且能夠反映出高度相似的臨床及組織病理學(xué)表現(xiàn)。
18、4、本專利技術(shù)可以在動(dòng)物上復(fù)制尋常痤瘡患者丘疹膿皰樣皮損的臨床表現(xiàn)及組織病理學(xué)表現(xiàn)，可用于長(zhǎng)期開(kāi)展尋常痤瘡動(dòng)物模型上的藥物研發(fā)及疾病機(jī)制探索等相關(guān)研究。
本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟1）中，選擇體外培養(yǎng)第8天的痤瘡丙酸桿菌生物膜。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟1）中，連續(xù)涂板計(jì)數(shù)后用PBS調(diào)整痤瘡丙酸桿菌生物膜懸液濃度為2×108CFU/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟2）中，選用周齡為6-8周的ICR小鼠。
5.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟2）中，皮內(nèi)注射部位選擇鼠耳近耳根部位中后2/3。
6.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟2）中，痤瘡丙酸桿菌生物膜的注射量為0.1ml。
7.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟3）中，注射區(qū)
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在包括如下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟1）中，選擇體外培養(yǎng)第8天的痤瘡丙酸桿菌生物膜。
3.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟1）中，連續(xù)涂板計(jì)數(shù)后用pbs調(diào)整痤瘡丙酸桿菌生物膜懸液濃度為2×108cfu/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建痤瘡丙酸桿菌生物膜致尋常痤瘡樣皮損動(dòng)物模型的方法，其特征在于步驟2）中，選用周齡為6-8...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：曾榮，李岷，謝媛媛，徐浩翔，周蒙，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒(méi)有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。