【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因編輯，尤其涉及一種zxdb基因敲除小鼠的構(gòu)建及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、zxdb基因(zinc?finger?x-linked?duplicated?b?gene，鋅指x連鎖重復(fù)b基因)位于人類x染色體的短臂(xp11.21)，zxdb基因的突變或變異可能與一些x染色體相關(guān)的遺傳病有關(guān)，在維持染色體的結(jié)構(gòu)和功能方面具有重要作用。
2、zxdb基因只含有一個(gè)外顯子，其cds區(qū)的gc含量約占70％。高gc含量的基因在使用crispr/cas9進(jìn)行編輯時(shí)面臨許多困難，gc堿基對(duì)之間形成三氫鍵(相比于at堿基對(duì)的兩氫鍵)，使得高gc區(qū)域的dna雙螺旋更為穩(wěn)定。同時(shí)，高gc含量的區(qū)域更容易形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾環(huán))，這都可能阻礙sgrna和cas9蛋白的有效結(jié)合和切割，也可能影響sgrna的轉(zhuǎn)錄效率和穩(wěn)定性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)所需解決的技術(shù)問題是如何利用crispr/cas9系統(tǒng)敲除小鼠或小鼠細(xì)胞中高gc含量的zxdb基因。
2、第一方面，本專利技術(shù)提供一種敲除小鼠細(xì)胞中zxdb基因的方法，所述方法采用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括靶向zxdb基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2；
3、所述sgrna1識(shí)別zxdb基因的靶序列為靶序列1，sgrna2識(shí)別zxdb基因的靶序列為靶序列2；
4、所述靶序列1為a1)-a3)中的一種：
5、a1)核
6、a2)與a1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性的由a1)衍生的dna序列；
7、a3)在嚴(yán)格條件下與a1)限定的dna序列雜交的由a1)衍生的dna序列；
8、所述靶序列2為b1)-b3)中的一種：
9、b1)核苷酸序列為seq?id?no:4的dna序列；
10、b2)與b1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性的由b1)衍生的dna序列；
11、b3)在嚴(yán)格條件下與b1)限定的dna序列雜交的由b1)衍生的dna序列。
12、本專利技術(shù)中的“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括與本專利技術(shù)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
13、上述75％或75％以上同一性，具體可為75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的同一性。
14、本專利技術(shù)中，所述嚴(yán)格條件可為如下：50℃，在7％十二烷基硫酸鈉(sds)、0.5mnapo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，2×ssc，0.1％sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?napo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，1×ssc，0.1％sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?napo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，0.5×ssc，0.1％sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5m?napo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在50℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；還可為：50℃，在7％sds、0.5mnapo4和1mm?edta的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×ssc，0.1％sds中漂洗；也可為：在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×ssc,0.1％sds和1×ssc,0.1％sds各洗膜一次；也可為：2×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；也可為：0.1×sspe(或0.1×ssc)、0.1％sds的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
15、上述方法中，所述sgrna1和sgrna2均由包括各自sgrna的靶序列和sgrna骨架編碼序列的dna序列體外轉(zhuǎn)錄后得到，所述sgrna骨架編碼序列為核苷酸序列是seq?id?no:12所示的dna序列，sgrna1是由核苷酸序列為seq?id?no:9的dna序列轉(zhuǎn)錄后得到，sgrna2是由核苷酸序列為seq?id?no:10的dna序列轉(zhuǎn)錄后得到。
16、如上所述的方法，所述方法包括向小鼠受體細(xì)胞中導(dǎo)入所述sgrna和cas蛋白，得到zxdb基因敲除的小鼠細(xì)胞。
17、如上所述的方法，所述受體細(xì)胞為受精卵。
18、如上所述的方法，所述cas蛋白為如下c1)-c3)中的至少一種：
19、c1)氨基酸序列為seq?id?no:17的蛋白質(zhì)；
20、c2)將c1)所述的蛋白質(zhì)的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)；
21、c3)與c1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；
22、c4)在c1)-c3)任一所述的蛋白質(zhì)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。
23、如上所述的方法，c3)中的同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用國際互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)測(cè)定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁。例如，可在高級(jí)blast2.1中，通過使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambdaratio分別設(shè)置為11，1和0.85(缺省值)并進(jìn)行檢索一對(duì)氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值(％)。
24、如上所述的方法，所述80％以上的同一性可以為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
25、如上所述的方法，c4)中，所述蛋白標(biāo)簽(protein-tag)是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化。所述蛋白標(biāo)簽可為flag標(biāo)簽、his標(biāo)簽、mbp標(biāo)簽、ha標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、gst標(biāo)簽和/或sumo標(biāo)簽等。
26、第二方面，本專利技術(shù)提供根據(jù)上述任一所述的方法制備得到的zxdb基因敲除的小鼠細(xì)胞。
27、第三方面，本專利技術(shù)提供一種獲得zxdb基因敲除小鼠的方法，包括：根據(jù)上述任一所述本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種敲除小鼠細(xì)胞中ZXDB基因的方法，其特征在于，所述方法采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行，所述CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括靶向ZXDB基因的sgRNA，所述sgRNA包括sgRNA1和sgRNA2；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括向小鼠受體細(xì)胞中導(dǎo)入所述sgRNA和Cas蛋白，得到ZXDB基因敲除的小鼠細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述受體細(xì)胞為受精卵。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述Cas蛋白為如下C1)-C3)中的至少一種：
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法制備得到的ZXDB基因敲除的小鼠細(xì)胞。
6.一種獲得ZXDB基因敲除小鼠的方法，其特征在于，包括：根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法制備得到ZXDB基因敲除的小鼠受精卵，并利用所述ZXDB基因敲除的小鼠受精卵獲得ZXDB基因敲除的小鼠。
7.權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的sgRNA和/或與所述sgRNA相關(guān)的生物材料，其特征在于，所述生物材料為D1)-D7)中的至少一種：
<...【技術(shù)特征摘要】
1.一種敲除小鼠細(xì)胞中zxdb基因的方法，其特征在于，所述方法采用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行，所述crispr/cas9系統(tǒng)包括靶向zxdb基因的sgrna，所述sgrna包括sgrna1和sgrna2；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括向小鼠受體細(xì)胞中導(dǎo)入所述sgrna和cas蛋白，得到zxdb基因敲除的小鼠細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述受體細(xì)胞為受精卵。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述cas蛋白為如下c1)-c3)中的至少一種：
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法制備得到的zxdb基因敲除的小鼠細(xì)胞。
6.一種獲得zxdb基因敲除小鼠的方法，其特征在于，包括：根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法制備...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：盧大儒，張楊，廖凱，陳松長，田亞飛，李夢(mèng)如，陳博文，陳紅巖，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：復(fù)旦大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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