【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物檢測，具體涉及一種快速檢測根毛霉和根霉的引物組及試劑盒及方法。
技術(shù)介紹
1、毛霉病(mucormycosis)是由毛霉目真菌引起的侵襲性真菌感染，毛霉真菌廣泛存在于自然環(huán)境中，例如土壤和腐爛的有機(jī)物。毛霉菌感染通過吸入孢子、創(chuàng)口感染等途徑進(jìn)入體內(nèi)，特別在免疫受損的患者中更易造成侵襲性感染，主要影響免疫功能低下的患者。近年來，毛霉病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，尤其在糖尿病、血液系統(tǒng)腫瘤和接受器官移植的患者中較為常見。近年在感染者(尤其是糖尿病患者)中也觀察到毛霉病的上升趨勢。毛霉病感染進(jìn)展迅速，死亡率較高，因而對其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的臨床檢測至關(guān)重要。
2、毛霉病的早期癥狀通常不具特異性，如發(fā)熱、呼吸困難等，這增加了臨床檢測的難度。毛霉病的診斷一般依賴于以下幾種方法：(1)直接鏡檢：從臨床標(biāo)本(如組織或分泌物)中觀察真菌孢子和菌絲結(jié)構(gòu)，鏡下呈現(xiàn)特征性的寬、無隔的真菌菌絲結(jié)構(gòu)。此方法快捷，但依賴于顯微鏡下的觀察技術(shù)，靈敏度較低，尤其對低濃度感染不敏感。(2)培養(yǎng)檢測：將臨床樣本進(jìn)行真菌培養(yǎng)，并對分離的菌株進(jìn)行鑒定。毛霉菌在培養(yǎng)基上生長迅速，但易被其他菌株或細(xì)菌污染。此外，該方法耗時較長，通常需要數(shù)天來培養(yǎng)分離出毛霉菌。(3)組織病理學(xué)檢測：通過活檢或手術(shù)獲取感染組織樣本，并進(jìn)行病理學(xué)分析。此方法可以確診毛霉病，但對患者損傷較大，且需要專業(yè)病理學(xué)設(shè)備和技術(shù)。(4)血清學(xué)檢測：血清學(xué)檢測在毛霉病診斷中應(yīng)用有限。雖然一些抗原檢測(如gm試驗)在曲霉病診斷中較為成熟，但在毛霉病中缺乏特異性抗原，因而血清學(xué)檢測
3、不同毛霉菌株的特異性標(biāo)記研究仍不足，因此在感染源多樣的情況下可能導(dǎo)致誤診或漏診(4)難以滿足毛霉菌的多樣性：一些分子生物學(xué)方法和病理學(xué)檢測需要多次才能涵蓋一種到幾種極有限的毛霉物種，增加了臨床應(yīng)用的成本等局限性。
4、鑒于此，提出本專利技術(shù)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對毛霉病原體檢測的需要診斷時間短、靈敏度/特異度高和涵蓋毛霉物種范圍廣的檢測需求，本專利技術(shù)提供了一種檢測多種毛霉的多重?zé)晒鈖cr引物、試劑盒及檢測方法，僅利用四對引物組探針進(jìn)行熒光pcr，即可對毛霉中常見感染的微小根毛霉、小孢根霉及根毛霉屬和根霉屬所涵蓋的毛霉物種進(jìn)行全面的檢測。該方法操作簡單，大大節(jié)省了時間、試劑和費用，并且能夠快速有效一次性檢測毛霉中常見物種和高靈敏度及特異性的優(yōu)勢。
2、實施方式1.一種快速檢測毛霉病原體的引物組，其特征在于，包括用于檢測微小根毛霉、小孢根霉、根毛霉屬、根霉屬中的一種或多種的擴(kuò)增引物對和探針，
3、其中，微小根毛霉的擴(kuò)增引物對的核苷酸序列如seq?id?no:1和seq?id?no:2所示，微小根毛霉的探針的核苷酸序列如seq?id?no:3所示；
4、小孢根霉的擴(kuò)增引物對的核苷酸序列如seq?id?no:4和seq?id?no:5所示，小孢根霉的探針的核苷酸序列如seq?id?no:6所示；
5、根毛霉屬的擴(kuò)增引物對的核苷酸序列如seq?id?no:7和seq?id?no:8所示，根毛霉屬的探針的核苷酸序列如seq?id?no:9所示；
6、根霉屬的擴(kuò)增引物對的核苷酸序列如seq?id?no:10和seq?id?no:11所示，根霉屬的探針的核苷酸序列如seq?id?no:12所示。
7、實施方式2.根據(jù)實施方式1所述的快速檢測毛霉病原體的引物組，其特征在于，所述毛霉病原體的探針為寡核苷酸熒光探針，其5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
8、實施方式3.一種快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，包括實施方式1或2所述的擴(kuò)增引物對和探針。
9、實施方式4.根據(jù)實施方式3所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括pcr混合液，所述pcr混合液包括dna聚合酶、dntp、mg2+、buffer。
10、實施方式5.根據(jù)實施方式3或4所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述的引物對和探針的摩爾濃度范圍為1～100μm，例如為5～10μm，例如為10～20μm，例如為20～50μm。
11、實施方式6.根據(jù)實施方式3或4所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于配制pcr反應(yīng)組合物。
12、實施方式7.根據(jù)實施方式3或4所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于熒光pcr檢測，包括以下步驟：
13、從樣本中提取dna，得到樣本dna；
14、制備pcr反應(yīng)組合物；
15、進(jìn)行pcr擴(kuò)增并檢測所述毛霉病原體；
16、其中，所述毛霉病原體包括微小根毛霉、小孢根霉、根毛霉屬、根霉屬中的一種或多種。
17、實施方式8.根據(jù)實施方式7所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述pcr反應(yīng)組合物如下制備：
18、將所述樣本dna、pcr混合液、無核酸酶水與實施方式1或2所述的引物組進(jìn)行充分混勻制得所述pcr反應(yīng)組合物。
19、實施方式9.一種實施方式3至8中任一項所述的試劑盒的非診斷目的的使用方法，其特征在于，包括采用實施方式3-8中任一項所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒進(jìn)行熒光pcr檢測，包括以下步驟：
20、從樣本中提取dna，得到樣本dna；
21、制備pcr反應(yīng)組合物；
22、進(jìn)行pcr擴(kuò)增并檢測所述毛霉病原體；
23、其中，所述毛霉病原體包括微小根毛霉、小孢根霉、根毛霉屬、根霉屬中的一種或多種。
24、實施方式10.根據(jù)實施方式9所述的方法，其特征在于，所述pcr反應(yīng)組合物如下制備：
25、將所述樣本dna、pcr混合液、無核酸酶水與實施方式1或2所述的引物組進(jìn)行充分混勻制得所述pcr反應(yīng)體系；
26、所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為：
27、預(yù)變性過程95℃1-5min?1個循環(huán)；變性和延伸過程95℃10-20s，59-61℃20-50s共40-45個循環(huán)。
28、實施方式11.根據(jù)實施方式10所述的方法，其特征在于，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件為：
29、預(yù)變性過程95℃3min?1個循環(huán)；變性和延伸過程95℃15s，60℃30s共45個循環(huán)。
30、本專利技術(shù)通過對毛霉病中常見的微小根毛霉、小孢根霉兩個物種及其本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種快速檢測毛霉病原體的引物組，其特征在于，包括用于檢測微小根毛霉、小孢根霉、根毛霉屬、根霉屬中的一種或多種的擴(kuò)增引物對和探針，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測毛霉病原體的引物組，其特征在于，所述毛霉病原體的探針為寡核苷酸熒光探針，其5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
3.一種快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的擴(kuò)增引物對和探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR混合液，所述PCR混合液包括DNA聚合酶、dNTP、Mg2+、Buffer。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述的引物對和探針的摩爾濃度范圍為1～100μM，例如為5～10μM，例如為10～20μM，例如為20～50μM。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于配制PCR反應(yīng)組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒用于
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)組合物如下制備：
9.一種權(quán)利要求3至8中任一項所述的試劑盒的非診斷目的的使用方法，其特征在于，包括采用權(quán)利要求3-8中任一項所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒進(jìn)行熒光PCR檢測，包括以下步驟：
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)組合物如下制備：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種快速檢測毛霉病原體的引物組，其特征在于，包括用于檢測微小根毛霉、小孢根霉、根毛霉屬、根霉屬中的一種或多種的擴(kuò)增引物對和探針，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測毛霉病原體的引物組，其特征在于，所述毛霉病原體的探針為寡核苷酸熒光探針，其5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
3.一種快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1或2所述的擴(kuò)增引物對和探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括pcr混合液，所述pcr混合液包括dna聚合酶、dntp、mg2+、buffer。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的快速檢測毛霉病原體的試劑盒，其特征在于，所述的引物對和探針的摩爾濃度范圍為1～...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王輝，尹玉瑤，李曙光，郭一凡，李振中，魏昭慧，
申請(專利權(quán))人：北京大學(xué)人民醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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