【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物品質性狀的分子標記，尤其涉及鑒定萬壽菊花型的caps分子標記、檢測引物和檢測試劑盒及其應用，屬于萬壽菊花型的caps分子標記領域。
技術介紹
1、萬壽菊(tagetes?erecta)為菊科萬壽菊屬的一年生植物，因其花大色艷、開花周期長、具有高觀賞價值而被廣泛應用于花壇、花境、切花等。萬壽菊具有獨特的頭狀花序結構，外圍是兩側對稱的舌狀小花，為單性花；中間是輻射對稱的管狀小花，為兩性花。根據管狀小花的花冠大小又分為蓮狀花型和冠狀花型，即小花花冠不膨大不伸長為蓮狀花型，小花花冠膨大伸長為冠狀花型。其中冠狀花型是萬壽菊近年來比較新穎的花型，是重要的育種目標。
2、測序技術的迅速發展，為花卉的分子育種提供了技術支持。bsa-seq(bulkedsegregant?analysis?sequencing)，即分離群體分組分析法結合全基因組測序技術對目標性狀的極端混池進行測序，可以篩選出大量snp(single?nucleotide?polymorphism)標記，以實現目標基因快速定位，同時可以開發連鎖的分子標記用于分子標記輔助育種。snp即單核苷酸多態性，屬于第三代dna分子標記，主要由于單個核苷酸(a、t、c、g)發生突變導致dna水平上發生序列改變。通過bsa-seq技術可以篩選到大量snp位點，基于snp位點進行snp分型的方法有很多，但是各有優缺點。其中，基于pcr擴增和酶切開發caps(cleavedamplified?polymorphic?sequence，酶切擴增多態性序列)標記對擴增產物進
3、對于觀賞價值主要集中在花上的萬壽菊而言，相比于蓮狀花，管狀花伸長膨大的冠狀花型更加飽滿圓潤，有著更高的觀賞價值。雖然通過傳統育種方法，待萬壽菊花完全盛開后，蓮狀花與冠狀花易于分辨，但其從苗期培育至完全開放過程中需要投入大量人力物力。利用bsa-seq技術，開發與萬壽菊蓮狀和冠狀花型相關的分子標記，能夠在苗期對蓮狀花型與冠狀花型的萬壽菊進行高效篩選，減少后期栽培和管理成本投入，極大地克服了傳統育種的不足、有效提高育種的效率。
技術實現思路
1、本專利技術的目的之一是提供一種鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型或其基因型純合度的caps分子標記；
2、本專利技術的目的之二是提供檢測所述caps分子標記的pcr檢測引物；
3、本專利技術的目的之三提供鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型或其基因型純合度的檢測試劑盒；
4、本專利技術的目的之四是將所述的caps分子標記、pcr檢測引物或檢測試劑盒應用于鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型或其基因型純合度等方面。
5、為了實現上述目的，本專利技術所采用的主要技術方案包括：
6、本專利技術的一方面是提供了一種鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型或其基因型純合度的caps分子標記，命名為marker?9.61，caps分子標記marker9.61在蓮狀花型萬壽菊的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，caps分子標記marker?9.61在冠狀花型萬壽菊的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
7、本專利技術的caps分子標記marker?9.61，在冠狀花型和蓮狀花型萬壽菊的序列中，位于322bp有一個snp位點差異，在冠狀花型中為g，而在蓮狀花型中為a，caps分子標記marker9.61與蓮狀花型、冠狀花型性狀緊密連鎖，表明本專利技術提供的特異性分子標記marker?9.61可用來鑒定萬壽菊的花型是蓮狀還是冠狀。
8、本專利技術的一種優選的具體實施方案，所述的檢測引物由seq?id?no.3所示的上游檢測引物和seq?id?no.4所示的下游檢測引物組成。
9、上述引物組可作為擴增caps分子標記的引物組，進而用于鑒定萬壽菊花型，因此，所述引物組在鑒定萬壽菊蓮狀花型或冠狀花型中的應用在本專利技術的保護范圍內。而且，包含上述的引物組、用于鑒定萬壽菊蓮狀花型或冠狀花型的試劑盒也在本專利技術的保護范圍內。
10、本專利技術的另一方面是提供了一種鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型或其基因型純合度的檢測試劑盒，包括：pcr?master?mix、pcr檢測引物；其中，所述的pcrmaster?mix包括：taq酶、dntp、mg2+；所述的檢測引物是以caps分子標記marker?9.61為靶標設計得到的pcr檢測引物；優選的，所述pcr檢測引物由seq?id?no.3所示和seq?id?no.4所示的兩條多核苷酸序列組成。
11、本專利技術的另一方面是將caps分子標記、pcr檢測引物或檢測試劑盒應用于鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型或其基因型純合度等方面。
12、本專利技術的一種優選的具體實施方案，應用所述的caps分子標記、pcr檢測引物鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型，包括：(1)以所述的caps分子標記marker?9.61為靶基因設計pcr檢測引物；(2)以待檢測萬壽菊樣品的dna為模板、以步驟(1)所設計的pcr檢測引物為上、下游引物建立pcr檢測體系對待檢測的萬壽菊dna樣品進行pcr擴增；(3)若擴增出491bp的條帶則為有效擴增；利用限制性內切酶xbaⅰ對pcr擴增產物進行酶切，若酶切產物為491bp的一條電泳條帶，則該萬壽菊樣本為蓮狀花型品種；若酶切產物是318bp和173bp的兩條電泳條帶，或者是491bp、318bp和173bp的三條電泳條帶則該萬壽菊樣本為冠狀花型品種。
13、本專利技術的一種優選的具體實施方案，應用所述的caps分子標記、pcr檢測引物鑒定萬壽菊冠狀花型的基因型的純合度，包括：(1)以所述的caps分子標記marker?9.61為靶基因設計pcr檢測引物；(2)以待檢測樣品的dna為模板、以步驟(1)所設計的pcr檢測引物建立pcr檢測體系對待檢測的樣品進行pcr擴增；(3)若擴增出491bp的條帶則為有效擴增；利用限制性內切酶xbaⅰ對pcr擴增產物進行酶切，如果酶切產物是318bp和173bp的兩條電泳條帶，則待檢測的萬壽菊樣品的花型是冠狀花型，且該冠狀花型的基因型是純合的；如果酶切產物是491bp、318bp和173bp的三條電泳條帶，則待檢測的萬壽菊樣品的花型是冠狀花型，且該冠狀花型的基因型是雜合的。
14、作為本專利技術一種優選的具體實施方案，所述pcr擴增的反應體系為：pcrmaster?mix(包括taq酶、dntp、mg2+)12.5μl、dna模板1μl、上游引物1μl、下游引物1μl，去離子水9.5μl。
15、作為本專利技術一種優選的具體實施方案，所述pcr擴增的反應程序為：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35個循環；72℃10min；20℃保溫5min。
16、在冠狀花型和蓮狀花型萬壽菊的核苷酸序列中，本專利技術的特異性caps分子標記marker?9.61存在一個snp位點變化(g→a)，純合的蓮狀本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型的CAPS分子標記Marker?9.61，其特征在于，所述CAPS分子標記Marker?9.61在蓮狀花型萬壽菊的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述CAPS分子標記Marker?9.61在冠狀花型萬壽菊的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.檢測權利要求1所述的CAPS分子標記Marker?9.61的PCR檢測引物。
3.根據權利要求2所述的PCR檢測引物，其特征在于，所述PCR檢測引物由核苷酸序列為SEQ?ID?NO.3所示的上游引物和核苷酸序列為SEQ?ID?NO.4所示的下游引物組成。
4.一種鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型的PCR檢測試劑盒，包括：PCRMasterMix、PCR檢測引物；其特征在于，所述的PCRMaster?Mix包括：Taq酶、dNTP、Mg2+；所述的PCR檢測引物是權利要求2或3所述的PCR檢測引物。
5.權利要求1所述的CAPS分子標記Marker?9.61在萬壽菊蓮狀和冠狀花型的鑒定或檢測中的應用、或權利要求2或3所述的PCR檢測引物在萬壽菊蓮狀和冠狀花型的
6.權利要求1所述的CAPS分子標記Marker?9.61在萬壽菊冠狀花型基因型的純合度的鑒定或檢測中的應用、或權利要求2或3所述的PCR檢測引物在萬壽菊冠狀花型的基因型的純合度的鑒定或檢測中的應用。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，包括：(1)以權利要求1所述的CAPS分子標記Marker?9.61為靶基因設計PCR檢測引物；(2)以待檢測萬壽菊樣品的DNA為模板、以步驟(1)所設計的PCR檢測引物為上、下游引物建立PCR檢測體系對待檢測的萬壽菊DNA樣品進行PCR擴增；(3)若擴增出491bp的條帶則為有效擴增；利用限制性內切酶XbaⅠ對PCR擴增產物進行酶切，若酶切產物為491bp的一條電泳條帶，則該萬壽菊樣本為蓮狀花型品種；若酶切產物是318bp和173bp的兩條電泳條帶，或者是491bp、318bp和173bp的三條電泳條帶則該萬壽菊樣本為冠狀花型品種。
8.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，包括：(1)以權利要求1所述的CAPS分子標記Marker?9.61為靶基因設計PCR檢測引物；(2)以待檢測樣品的DNA為模板、以步驟(1)所設計的PCR檢測引物建立PCR檢測體系對待檢測的樣品進行PCR擴增；(3)若擴增出491bp的條帶則為有效擴增；利用限制性內切酶XbaⅠ對PCR擴增產物進行酶切，如果酶切產物是318bp和173bp的兩條電泳條帶，則待檢測的萬壽菊樣品的花型是冠狀花型，且該冠狀花型的基因型是純合的；如果酶切產物是491bp、318bp和173bp的三條電泳條帶，則待檢測的萬壽菊樣品的花型是冠狀花型，且該冠狀花型的基因型是雜合的。
9.按照權利要求7或8所述的應用，其特征在于，所述PCR擴增的反應體系為：PCR?Master?Mix?12.5μL、DNA模板1μL、上游引物1μL、下游引物1μL，去離子水9.5μL。
10.按照權利要求7或8所述的應用，其特征在于，所述PCR擴增的反應程序為：94℃4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，共35個循環；72℃10min；20℃保溫5min。
...【技術特征摘要】
1.鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型的caps分子標記marker?9.61，其特征在于，所述caps分子標記marker?9.61在蓮狀花型萬壽菊的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述caps分子標記marker?9.61在冠狀花型萬壽菊的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
2.檢測權利要求1所述的caps分子標記marker?9.61的pcr檢測引物。
3.根據權利要求2所述的pcr檢測引物，其特征在于，所述pcr檢測引物由核苷酸序列為seq?id?no.3所示的上游引物和核苷酸序列為seq?id?no.4所示的下游引物組成。
4.一種鑒定萬壽菊蓮狀和冠狀花型的pcr檢測試劑盒，包括：pcrmastermix、pcr檢測引物；其特征在于，所述的pcrmaster?mix包括：taq酶、dntp、mg2+；所述的pcr檢測引物是權利要求2或3所述的pcr檢測引物。
5.權利要求1所述的caps分子標記marker?9.61在萬壽菊蓮狀和冠狀花型的鑒定或檢測中的應用、或權利要求2或3所述的pcr檢測引物在萬壽菊蓮狀和冠狀花型的鑒定或檢測中的應用。
6.權利要求1所述的caps分子標記marker?9.61在萬壽菊冠狀花型基因型的純合度的鑒定或檢測中的應用、或權利要求2或3所述的pcr檢測引物在萬壽菊冠狀花型的基因型的純合度的鑒定或檢測中的應用。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，包括：(1)以權利要求1所述的caps分子標記marker?9.61為靶基因設計pcr檢測引物；(2)以待檢測萬壽菊樣品的dna為模板、以步驟...
【專利技術屬性】
技術研發人員：何燕紅，胡詩蕊，劉雨菡，張華麗，解雯然，
申請(專利權)人：華中農業大學，
類型：發明
國別省市：
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