【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本申請涉及基因工程，具體涉及靶向敲除lpa基因的sgrna、重組表達載體及敲除lpa基因的方法。
技術(shù)介紹
1、心血管疾病是全球范圍內(nèi)威脅人類健康的最主要的疾病，其中以動脈粥樣硬化性心血管疾病(ascvd)為主的心血管病的死亡率占40％以上，并仍有逐年增加的趨勢。ascvd的危險因素包括吸煙、高血壓、糖尿病、高脂血癥等，其中低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)是ascvd的致病性危險因素。大量的臨床研究實驗證據(jù)均證實了ldl-c水平降低的程度與ascvd的事件發(fā)生率呈正相關。然而，近些年隨著對脂蛋白研究的深入，越來越多的證據(jù)表明脂蛋白a[lp(a)]也是參與ascvd病理生理機制的重要因素。
2、lp(a)是由兩種蛋白apo(a)和apob-100組成，其中apo(a)主要由lpa基因編碼。lpa基因編碼兩個kringle結(jié)構(gòu)域(kiv和kv)，kiv再繼續(xù)擴展至10個亞型，其中kiv2在不同人群中存在基因拷貝數(shù)的變異，造成1～40多個重復拷貝。所有的kiv拷貝都能進行轉(zhuǎn)錄及翻譯，kiv拷貝數(shù)少，apo(a)蛋白的合成及分泌就快，因此造成了apo(a)蛋白大小的多態(tài)性及l(fā)p(a)血漿濃度的高度遺傳性。血漿lp(a)的水平在人群中呈偏態(tài)分布，范圍從<0.1mg/dl至>300mg/dl不等，不同種族之間差異也較大。lp(a)水平每增加50nmol/l，ascvd的風險增加10％。即使在ldl-c水平較低的情況下，lp(a)的水平增高也會增加ascvd的風險。
3、目前最常見的降脂方式包括改善生活方式
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本申請?zhí)峁┝税邢蚯贸齦pa基因的sgrna、重組表達載體及敲除lpa基因的方法，利用crispr/cas9基因編輯系統(tǒng)的特點，針對lpa基因全部外顯子及內(nèi)含子設計了所有能進行基因敲除的靶點，并對其編輯效率及表達水平進行評估，為未來臨床上新藥的篩選提供了新靶點。
2、為了實現(xiàn)上述專利技術(shù)目的，本申請?zhí)峁┮韵录夹g(shù)方案：
3、一方面，本申請?zhí)峁┝税邢蚯贸齦pa基因的sgrna，所述sgrna的核苷酸序列選自如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.9、seq?id?no.11、seq?idno.3、seq?id?no.4、seqid?no.5、seq?id?no.14、seq?id?no.15所示的序列中的任意一種。
4、第二方面，本申請?zhí)峁┝税邢蚯贸齦pa基因的重組表達載體，所述重組表達載體包括上述的sgrna。
5、第三方面，本申請?zhí)峁┝松鲜霭邢蚯贸齦pa基因的重組表達載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
6、(1)設計并合成所述的sgrna；
7、(2)在所述sgrna的序列的5’端添加bbsi的酶切位點caccg，得到序列5’-caccg-sgrna-3’，并合成其互補序列5’-aaac-sgrna-c-3’；
8、(3)將所述序列5’-caccg-sgrna-3’和5’-aaac-sgrna-c-3’進行退火，得到雙鏈dna分子；
9、(4)將所述雙鏈dna分子與載體連接，得到所述靶向敲除lpa基因的重組表達載體。
10、可選地，步驟(3)中，所述退火的溫度為94～96℃；
11、所述退火的時間為4～6min。
12、可選地，步驟(3)中，所述退火的溫度獨立地選自94℃、95℃、96℃中的任意值或任意兩者之間的范圍值。
13、可選地，步驟(3)中，所述退火的時間獨立地選自4min、5min、6min中的任意值或任意兩者之間的范圍值。
14、可選地，步驟(4)中，所述載體中包含cas9蛋白。
15、可選地，步驟(4)中，所述載體包括經(jīng)bbsi酶切的px459載體。
16、第四方面，本申請?zhí)峁┝嘶赾rispr-cas9系統(tǒng)特異性敲除lpa基因的方法，包括如下步驟：
17、將上述的重組表達載體導入到細胞中，對lpa進行基因編輯以定向敲除lpa基因。
18、可選地，所述導入的方式包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。
19、可選地，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染量為2～4μg。
20、可選地，所述脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法的轉(zhuǎn)染量獨立地選自2μg、3μg、4μg中的任意值或任意兩者之間的范圍值。
21、可選地，所述細胞包括hek293t細胞或hepg2細胞。
22、優(yōu)選地，所述細胞為hepg2細胞。
23、可選地，將導入重組表達載體的細胞培養(yǎng)48小時，提取上述步驟所得細胞的基因組dna，pcr后進行基因測序鑒定，觀察其基因編輯效率；同時提取上述步驟所得細胞的rna，real-time?pcr后進行l(wèi)pa的mrna水平檢測。
24、本申請還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：
25、遞送載體和上述的sgrna、或所述的表達載體。
26、示例性地，所述遞送載體選自聚合物脂質(zhì)體、納米顆粒、病毒載體或細胞外囊泡中的一種或多種。
27、本申請還提供了本文所述的sgrna、本文所述的表達載體或本文所述的藥物組合物在制備以下產(chǎn)品之一中的用途：
28、1)體外編輯lpa基因的產(chǎn)品；
29、2)降低載脂蛋白(a)和脂蛋白(a)的產(chǎn)品；
30、3)心血管疾病治療藥物。
31、示例性地，所述心血管疾病選自高膽固醇血癥、冠心病、高血壓、心肌梗死、中風、周血管疾病或主動脈粥樣硬化中的一種或多種。
32、本申請還提供一種體外特異性敲除lpa基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：
33、將本文所述的sgrna，本文所述的重組表達載體導入到細胞中，對lpa進行基因編輯以定向敲除lpa基因。
34、示例性地，所述導入的方式包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒轉(zhuǎn)導、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊或基因槍轉(zhuǎn)化中的一種或多種。
35、在本申請中，所述的crispr-cas9系統(tǒng)是指適合被人工改造的crispr-cas系統(tǒng)，源于古細菌ii型(crispr)-crispr-associated?protein(cas)系統(tǒng)的核酸酶體系，與zfn和talen相比，該體系更簡單、操作更方便。
36、在本申請中，采用rna引導的核酸內(nèi)切酶(rna-guided?endonucleases，rgens)實現(xiàn)對目標基因序列的特異性切割，rg本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.靶向敲除LPA基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列包含選自如SEQ?IDNo.1、SEQ?ID?No.2、SEQ?ID?No.9、SEQ?ID?No.11、SEQ?IDNo.3、SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.14、SEQ?ID?No.15所示的序列中的任意一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向敲除LPA基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列包含如SEQ?ID?No.11、SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4、SEQ?ID?No.5、SEQ?ID?No.14、SEQID?No.15所示的序列。
3.靶向敲除LPA基因的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體含有權(quán)利要求1或2所述的sgRNA。
4.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含：
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的藥物組合物，其特征在于，所述遞送載體選自聚合物脂質(zhì)體、納米顆粒、病毒載體或細胞外囊泡中的一種或多種。
6.如權(quán)利要求1-2任一所述的sgRNA、如權(quán)利要求3所述的表達
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述心血管疾病選自高膽固醇血癥、冠心病、高血壓、心肌梗死、中風、周血管疾病或主動脈粥樣硬化中的一種或多種。
8.一種體外特異性敲除LPA基因的方法，其特征在于，包括如下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的體外特異性敲除LPA基因的方法，其特征在于，所述導入的方式包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、病毒轉(zhuǎn)導、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊或基因槍轉(zhuǎn)化中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的體外特異性敲除LPA基因的方法，其特征在于，所述細胞包括HEK293T細胞或HepG2細胞。
...【技術(shù)特征摘要】
1.靶向敲除lpa基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列包含選自如seq?idno.1、seq?id?no.2、seq?id?no.9、seq?id?no.11、seq?idno.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5、seq?id?no.14、seq?id?no.15所示的序列中的任意一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶向敲除lpa基因的sgrna，其特征在于，所述sgrna的核苷酸序列包含如seq?id?no.11、seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5、seq?id?no.14、seqid?no.15所示的序列。
3.靶向敲除lpa基因的重組表達載體，其特征在于，所述重組表達載體含有權(quán)利要求1或2所述的sgrna。
4.一種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含：
5.根據(jù)權(quán)利要求...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：董建增，鄭詩悅，方光明，杜昕，杜杰，高詩娟，李玉琳，馬長生，
申請(專利權(quán))人：首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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