【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物樣品檢測(cè)，尤其涉及一種利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)尿液中vma、hva和5-hiaa含量的方法。
技術(shù)介紹
1、香草扁桃酸(vma)和高香草酸(hva)是嗜鉻細(xì)胞瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤及神經(jīng)母細(xì)胞瘤篩查的輔助診斷指標(biāo)，而5-羥吲哚乙酸(5-hiaa)是類癌瘤篩查推薦的一線指標(biāo)，因此這三個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)對(duì)于神經(jīng)內(nèi)分泌瘤的診斷具有重要意義。
2、vma、hva和5-hiaa的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有微柱比色法，酶聯(lián)免疫法，液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法和氣相色譜-質(zhì)譜法，這些方法均存在前處理過(guò)程復(fù)雜且步驟繁瑣的缺點(diǎn)，且檢測(cè)靈敏度有限的問(wèn)題。近年來(lái)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid?chromatography?tandem?massspectrometry,lc-ms/ms)越來(lái)越多的被用于vma、hva和5-hiaa的檢測(cè)，該方法具有靈敏度高、特異性好、通量高和耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)。為了除去樣品蛋白的干擾，檢測(cè)前通常需要對(duì)樣本進(jìn)行前處理，目前已發(fā)表的文獻(xiàn)中所報(bào)道的前處理方法多為固相萃取法(solid?phaseextraction，spe)，這些前處理方法存在操作步驟、樣本用量大、耗時(shí)長(zhǎng)、試劑耗材成本高和污染環(huán)境的問(wèn)題。
3、專利cn202310280452.9公開了尿液中香草扁桃酸和高香草酸的檢測(cè)方法及其應(yīng)用，樣品前處理包括使用含有有機(jī)相的萃取液萃取待測(cè)樣本，所述有機(jī)相包括正己烷、二氯甲烷或乙酸乙酯，待測(cè)樣本在萃取前，先使用稀釋液稀釋，然后加入萃取液萃取，萃取后將分離的有機(jī)相氮吹吹干，復(fù)溶后采用高效液相色譜檢測(cè)。但該專利技術(shù)
4、因此需要開發(fā)一種簡(jiǎn)單快速、穩(wěn)定可靠且樣本用量小的定量檢測(cè)分析方法以實(shí)現(xiàn)尿液中vma、hva和5-hiaa含量的準(zhǔn)確測(cè)定。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)尿液中vma、hva和5-hiaa含量的方法，該方法簡(jiǎn)單快速、穩(wěn)定可靠且樣本用量小。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本申請(qǐng)采用了如下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了一種利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)尿液中vma、hva和5-hiaa含量的方法，包括以下步驟：
4、s1，空白尿基質(zhì)制備：采用陰離子交換樹脂去除尿液中的游離vma、hva和5-hiaa后得到所述空白尿基質(zhì)；
5、s2，定標(biāo)品制備：分別稱量一定量的vma、hva和5-hiaa固體粉末，用甲醇定容(例如：1-2mg/ml)，溶解后的液體作為vma、hva和5-hiaa的母液，三者按照一定的比例(例如：0.5:1:1或1:1:1)混合后再用一定體積比(例如：1:3,1:1或3:1)的甲醇-水稀釋得到vma、hva和5-hiaa工作液，最后用所述空白尿基質(zhì)逐級(jí)稀釋得到不同濃度的所述定標(biāo)品；
6、s3，樣品前處理：分別取待測(cè)尿液樣本、所述定標(biāo)品和質(zhì)控品，加入vma、hva和5-hiaa同位素的混合內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋混勻后離心，取上清液，得到待測(cè)尿液樣本上清液、定標(biāo)品上清液和質(zhì)控品上清液；
7、s4，液相色譜分離：利用液相色譜及相應(yīng)的流動(dòng)相對(duì)上述上清液分別進(jìn)行分離；
8、s5，串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)：液相色譜分離出的上述上清液直接進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到待測(cè)尿液樣本中vma、hva和5-hiaa的含量。
9、在以上技術(shù)方案中，s2中，所述定標(biāo)品的濃度控制在1.0-500μmol/l之間。
10、在以上技術(shù)方案中，s3中，所述混合內(nèi)標(biāo)工作液的溶劑為甲醇-水混合物，甲醇與水體積比為1:3、1:1或3:1。
11、在以上技術(shù)方案中，s3中，所述待測(cè)尿液樣本/定標(biāo)品/質(zhì)控品與所述混合內(nèi)標(biāo)工作液的體積比為1:(3～5)。
12、在以上技術(shù)方案中，s4中，液相色譜的條件為：
13、色譜柱：c18色譜柱；
14、柱溫：35±5℃；
15、進(jìn)樣量：2-10μl；
16、流速：0.1-0.4ml/min；
17、流動(dòng)相a為0-0.1wt％甲酸水溶液，流動(dòng)相b為0-0.1wt％甲酸的甲醇溶液，采用等度洗脫。
18、在以上技術(shù)方案中，s4中，液相梯度為：
19、0-1.80min,流動(dòng)相a的體積百分比為50％-70％，流動(dòng)相b的體積百分比為30％-50％；
20、1.81min，流動(dòng)相a的體積百分比0-10％，流動(dòng)相b的體積百分比為90％-100％；
21、1.81-3.00min，流動(dòng)相a的體積百分比為0-10％，流動(dòng)相b的體積百分比為90％-100％；
22、3.01min，動(dòng)相a的體積百分比為50％-70％，流動(dòng)相b的體積百分比為30％-50％；
23、3.01-4.00min，動(dòng)相a的體積百分比為50％-70％，流動(dòng)相b的體積百分比為30％-50％。
24、在以上技術(shù)方案中，s5中，質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子，負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；
25、其中離子源參數(shù)包括：氣簾氣：30±2psi，離子源溫度：550±10℃，離子源電壓：-4500±10v，霧化氣40±5psi，輔助氣：50±5psi。
26、在以上技術(shù)方案中，質(zhì)譜參數(shù)為：
27、vma離子子對(duì)：197.0>137.0；
28、vma-d3離子對(duì)：200.0>140.0；
29、hva離子子對(duì)：181.0>122.0；
30、hva-d3離子對(duì)：184.0>122.0；
31本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)尿液中VMA、HVA和5-HIAA含量的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：S2中，所述定標(biāo)品的濃度控制在1.0-500μmol/L之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：S3中，所述混合內(nèi)標(biāo)工作液的溶劑為甲醇-水混合物，甲醇與水體積比為1:3、1:1或3:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：S3中，所述待測(cè)尿液樣本/定標(biāo)品/質(zhì)控品與所述混合內(nèi)標(biāo)工作液的體積比為1:(3～5)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：S4中，液相色譜的條件為：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：S4中，液相梯度為：
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：S5中，質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子，負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：S5中，質(zhì)譜參數(shù)為：
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：S3中，離心的條件為常溫，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm以上，時(shí)間2-10min。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)尿液中vma、hva和5-hiaa含量的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：s2中，所述定標(biāo)品的濃度控制在1.0-500μmol/l之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：s3中，所述混合內(nèi)標(biāo)工作液的溶劑為甲醇-水混合物，甲醇與水體積比為1:3、1:1或3:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于：s3中，所述待測(cè)尿液樣本/定標(biāo)品/質(zhì)控品與所述混合內(nèi)標(biāo)工作液的體積比為1...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：沈瑩，程黎明，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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